2.2.25 Absorpční spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti
2000
Absorbance A je definována jako dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance T pro monochromatické záření a je vyjádřena vztahem:
| A = log10 | 1 | = log 10 | I0 | , |
| T | I |
v němž značí:
| T | - I/l0, |
| I0 | - intenzitu dopadajícího monochromatického záření, |
| I | - intenzitu prošlého monochromatického záření. |
V homogenním prostředí je měřená absorbance (A) úměrná tloušťce vrstvy (b), kterou záření prochází a koncentraci absorbující látky v roztoku (c) podle vztahu:
A=ε·c·b,
v němž značí:
ε - molární absorpční koeficient (absorptivita), je-li koncentrace (c) vyjádřena v mol/l a tloušťka vrstvy (b) v cm.
Výraz A1%1cm, je specifická absorbance, která vyjadřuje absorbanci roztoku látky o koncentraci 10 g/l měřenou v 1cm vrstvě při určité vlnové délce:
| A1%1cm = | 10ε | , |
| Mr |
Není-li uvedeno jinak, měří se absorbance při předepsané vlnové délce v 1cm vrstvě při (20 ± 1) °C a měření se provádí proti použitému rozpoušťtědlu nebo směsi rozpoušťědel. Absorbance použitého rozpouštědla měřená proti vzduchu při předepsané vlnové délce by neměla být vyšší než 0,4, a je přednostně menší než 0,2. Absorpční spektrum se vynese jako závislost absorbance nebo její funkce (osa pořadnic) na vlnové délce nebo její funkci (osa úseček).
Jestliže v článcích je uváděna jedna hodnota vlnové délky pro maximum absorpce, může se nalezená hodnota od této lišit nejvýše o ± 2 nm.
Zařízení. Spektrofotometry vhodné pro měření v ultrafialové a viditelné oblasti spektra se skládají z optického systému schopného poskytovat monochromatické záření v rozsahu 200 nm až 800 nm a ze zařízení vhodného pro měření absorbance.
Kontrola vlnových délek. Správnost stupnice vlnových délek se ověřuje pomocí hodnot absorpčních maxim roztoku chloristanu holmitého R, poloh čar pro vodíkovou, resp. deuteriovou lampu nebo poloh čar pro rtuťové páry, které jsou uvedeny v tabulce 2.2.25-1. Povolená tolerance je ± 1 nm pro ultrafialovou oblast a ± 3 nm pro viditelnou oblast.
Tab. 2.2.25-1 Absorpční maxima pro kontrolu stupnice vlnových délek.
| 241,15 nm (Ho) | 404,66 nm (Hg) |
| 253,7 nm (Hg) | 435,83 nm (Hg) |
| 287,15 nm (Ho) | 486,0 nm (Dβ) |
| 302,25 nm (Hg) | 486,1 nm (Hβ) |
| 313,16 nm (Hg) | 536,3 nm (Ho) |
| 334,15 nm (Hg) | 546,07 nm (Hg) |
| 361,5 nm (Ho) | 576,96 nm (Hg) |
| 365,48 nm (Hg) | 579,07 nm (Hg) |
Kontrola absorbance. Správnost stupnice absorbance se ověřuje roztokem dichromanu draselného R při vlnových délkách uvedených vtabulce 2.2.25-2, v níž jsou pro každou vlnovou délku udány přesné hodnoty specifické absorbance a povolené limity. Tolerance pro absorbanci je ± 0,01. Pro kontrolu absorbance se použije roztoku dichromanu draselného R připraveného takto: rozpustí se 57,0 mg až 63,0 mg dichromanu draselného R předem vysušeného při 130 °C do konstantní hmotnosti v kyselině sírové 0,005 mol/l RS a zředí se jí na 1000,0 ml.
Tab. 2.2.25-2
| Vlnová délka (nm) |
Specifická absorbance A1%1cm |
Maxima tolerance |
| 235 | 124,5 | 122,9 až 126,2 |
| 257 | 144,5 | 142,8 až 146,2 |
| 313 | 48,6 | 47,0 až 50,3 |
| 350 | 107,3 | 105,6 až 109,0 |
Limit rozptýleného světla může být sledován při daných vlnových délkách pomocí vhodných roztoků nebo filtrů. Např. absorbance roztoku chloridu draselného R (12 g/l) měřená v 1cm vrstvě při 200 nm musí být vyšší než 2 v porovnání s vodou R jako kontrolní kapalinou.
Rozlišovací schopnost (pro kvalitativní analýzu). Pokud je to předepsáno v článku, je třeba provést měření rozlišovací schopnosti přístroje takto: zaznamená se spektrum roztoku toluenu R 0,0 2% (V/V) v hexanu R. minimální poměr absorbance v maximu při 269 nm k absorbanci v minimu při 266 nm je uveden v článku.
Spektrální šířka štěrbiny (pro kvantitativní analýzu). Aby se předešlo chybám při měření způsobeným spektrální šířkou štěrbiny při použití přístroje, kde šířka štěrbiny při zvolené vlnové délce může být měněna, musí být šířka štěrbiny malá ve srovnání s polovinou šířky absorpčního pásu, ale současně musí být co největší, aby byla získána vysoká hodnota l0. V každém případě šířka štěrbiny přístroje by měla být vždy taková, aby při jejím dalším zmenšení nedocházelo ke změnám v odečtu absorbance.
Kyvety. Povolená tolerance vnitřní vzdálenosti protilehlých stěn používaných kyvet je ± 0,005 cm. Naplní-li se týmž rozpouštědlem, musí kyvety pro zkoušený roztok a pro kontrolní kapalinu mít stejnou transmitanci. V opačném případě je třeba zavést příslušnou korekci.
Kyvety je nutno čistit a zacházet s nimi opatrně.
Derivační spektrofotometrie
Derivační spektrofotometrie znamená transformaci absorpčního spektra (nultého řádu) v 1., 2. nebo vyšší derivaci spektra.
První derivace spektra (derivační spektrum 1. řádu) je závislost gradientu absorpční křivky (změna absorbance s vlnovou délkou, dA/dλ, ) na vlnové délce.
Druhá derivace spektra (derivační spektrum 2. řádu) je závislost zakřivení absorpčního spektra na vlnové délce (d2A/dλ2). Druhá derivace při jakékoliv vlnové délce λ je úměrná koncentraci podle následujících rovnic:
| d2A | = | d2A1%1cm | · | c'b | = | d2A ε | · | cb | , |
| dλ2 | dλ2 | 10 | dλ2 | 10 |
v nichž značí:
c' - koncentraci absorbující látky v g/l.
Zařízeni. Použije se spektrofotometr vybavený analogovým odporově-kapacitním diferenčním modulem nebo digitálním diferenciátorem, nebo případně jiným zařízením vytvářejícím derivační spektra. U některých metod tvorby druhé derivace spektra vzniká vlnový posun vzhledem ke spektru nultého řádu, a to je nutno v těchto případech uvažovat.
Obr. 2.2.25-1
Rozlišovací schopnost. Pokud je předepsáno v článku, zaznamená se derivační spektrum druhého řádu roztoku toluenu R (0,2 g/l) v methanolu R za použití methanolu R jako kontrolní kapaliny. Ve spektru je malý záporný extrém umístěný mezi dvěma velkými zápornými extrémy při 261 nm a 268 nm, viz obrázek 2.2.25-1. Není-li uvedeno jinak, poměr A/B (viz obrázek 2.2.25-1) není menší než 0,2.
Pracovní postup. Připraví se roztok zkoušené látky, nastaví se vhodné instrumentální podmínky podle návodu výrobce a množství stanovované látky se vypočítá způsobem uvedeným v článku.