2.2.27   Tenkovrstvá chromatografie

2001

Tenkovrstvá chromatografie je separační metoda, u které stacionární fázi tvoří vhodný materiál nanesený v rovnoměrné tenké vrstvě na skleněný, kovový nebo plastový podklad (desku). Roztoky stanovovaných látek se na vrstvu nanášejí před vyvíjením. Dělení (separace) je založeno na adsorpci, rozdělení, iontové výměně nebo na kombinaci těchto mechanismů a dochází k němu migrací (vyvíjením) rozpuštěných látek v rozpouštědle nebo vhodné směsi rozpouštědel (mobilní fáze) tenkou vrstvou (stacionární fáze).

Zařízení

Desky. Chromatografie se provádí za použití desek předem potažených vrstvou, popsaných ve stati Zkoumadla (4.1.1).
Předběžná úprava vrstev. Před dělením mohou být vrstvy, je-li třeba, promyty, např. může být provedeno vyvíjení vhodným rozpouštědlem. Vrstvy mohou být rovněž impregnovány vyvíjením, ponořením nebo postřikem. Je-li nutné, vrstvy je možno před použitím aktivovat zahříváním v sušárně při 100 °C až 105 °C po dobu 1 h.
Chromatografická komora s plochým nebo dvojžlábkovým dnem z inertního průhledného materiálu vhodné velikosti pro použité desky, opatřená dobře těsnicím víkem. Komora pro horizontální vyvíjení je opatřena žlábkem pro mobilní fázi a přídavným zařízením umožňujícím přímý kontakt mobilní fáze a stacionární fáze.
Mikropipety, mikrostříkačky (injekční), kalibrované kapiláry pro jedno použití nebo jiné nanášecí zařízení, které je vhodné pro správné nanášení roztoků.
Fluorescenční detekční zařízení pro přímé hodnocení fluorescence nebo zhášení fluorescence.
Detekční činidla pro detekci oddělených skvrn postřikem, vystavením vlivu par nebo ponořením.

Pracovní postup

Vertikální vyvíjení. Stěny chromatografické komory se vyloží filtračním papírem. Do chromatografické komory se nalije podle její velikosti takové množství mobilní fáze, aby po impregnaci filtračního papíru byla vrstva ponořena
do vhodné hloubky, vzhledem k rozměrům použité desky. Pro nasycení se komora uzavře víkem a nechá se stát l h při 20 °C až 25 °C. Není-li předepsáno jinak, chromatografické dělení se provádí v nasycené komoře.

Nanese se předepsaný objem roztoků po dostatečně malých dávkách ve Formě proužků nebo kruhových skvrn ve vhodné vzdálenosti od spodního okraje a bočních okrajů desky. Roztoky se nanášejí na start rovnoběžně se spodním okrajem desky tak, aby vzdálenost mezi skvrnami byla nejméně 10 mm.

Po odpaření rozpouštědla z nanesených roztoků se deska s vrstvou vloží do chromatografické komory tak, aby byla v co nejvíce vertikální poloze a skvrny nebo proužky byly nad hladinou mobilní fáze. Komora se uzavře, udržuje se při teplotě 20 °C až 25 °C a chrání se před slunečním světlem. Deska s vrstvou se vyjme, když mobilní fáze dosáhne předepsané vzdálenosti, vysuší se a deteguje se předepsaným způsobem.

Pro dvojrozměrnou chromatografii se vrstva po prvním vyvíjení vysuší a provede se druhé vyvíjení ve směru kolmém na směr prvního vyvíjení.

Horizontální vyvíjení. Nanese se předepsaný objem roztoků po dostatečně malých dávkách tak, aby vznikly kruhové skvrny o průměru 1 mm až 2 mm nebo proužky 5 mm až 10 mm krát 1 mm až 2 mm ve vhodné vzdálenosti od spodního okraje a bočních okrajů desky. Roztoky se nanášejí na start rovnoběžně se spodním okrajem desky tak, aby vzdálenost mezi skvrnami byla nejméně 5 mm. Po odpaření rozpouštědla z nanesených roztoků se pomocí injekční stříkačky nebo pipety vnese do žlábku vyvíjecí komory vhodné množství mobilní fáze, deska s vrstvou se do chromatografické komory umístí horizontálně a spojí se s mobilní fází zařízením podle pokynů výrobce. Je-li předepsáno, vyvíjení se započne současně z obou stran. Komora se uzavře a udržuje se při teplotě 20 °C až 25 °C. Deska s vrstvou se vyjme, když mobilní fáze dosáhne vzdálenosti předepsané v článku, vysuší se a chromatogramy se detegují předepsaným způsobem.

Pro dvojrozměrnou chromatografii se vrstva po prvním vyvíjení vysuší a provede se druhé vyvíjení ve směru kolmém na směr prvního vyvíjení.

Vizuální hodnocení

Zkouška totožnosti. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se vizuálně porovnává s odpovídající skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku porovnáním zbarvení, velikosti a retenčního faktoru (R_F) obou skvrn.
Retenční faktor (R_F) je definován jako poměr vzdálenosti středu skvrny ke vzdálenosti čela mobilní fáze, měřeno od místa nanášení.
Ověření separační schopnosti pro zkoušky totožnosti. Obvykle je dostačující provedení testu způsobilosti popsaného ve stati Zkoumadla (4.1.1). Pouze ve zvláštních případech může být v článku předepsáno další kritérium pro test způsobilosti.
Zkouška na příbuzné Látky. Vedlejší skvrna (skvrny) na chromatogramu zkoušeného roztoku se vizuálně porovnává (porovnávají) s odpovídajícími) skvrnou (skvrnami) na chromatogramu porovnávacího roztoku obsahujícího nečistotu (nečistoty) nebo se skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku připraveného ředěním zkoušeného roztoku.
    Ověření separační schopnosti. Požadavky na ověření separační schopnosti jsou uvedeny v příslušném článku.    
    Ověřeni detekční schopnosti. Detekční schopnost je dostatečná, je-li skvrna (nebo proužek) na chromatogramu nejzředěnějšího porovnávacího roztoku zřetelné viditelná.

Kvantitativní stanovení

Požadavky na rozlišení a dělení jsou uvedeny v jednotlivých článcích.

Látky oddělené tenkovrstvou chromatografif a detegovatelné v ultrafialové nebo viditelné oblasti spektra mohou být stanoveny přímo na desce s vrstvou za použití vhodného přístrojového vybavení. Deska s vrstvou se hodnotí měřením reflektance nebo transmitance dopadajícího světla, přičemž se pohybuje bud' deska, nebo měřicí zařízení. Podobně za použití vhodného optického systému může být měřena fluorescence. Látky obsahující radionuklidy mohou být kvantifikovány třemi způsoby: bud' přímým měřením radioaktivity podél celého chromatogramu (viz Radiofarmaca) nebo po rozstříhání desky na proužky měřením radioaktivity každého jednotlivého proužku za použití vhodného detektoru, a/nebo po seškrabání stacionární fáze a rozpuštění ve vhodné scintilační kapalině měřením její radioaktivity za použití kapalinového scintilačního detektoru.

Zařízení. Přístrojové vybavení pro přímé měření na desce s vrstvou se skládá:

• ze zařízení pro přesné umístění a reprodukovatelné dávkování množství látek na vrstvu,
• z mechanického zařízení pro pohyb desky nebo měřicího zařízení ve směru osy x nebo osy y.
• ze zapisovače a vhodného integrátoru nebo počítače,
• pro látky detegovatelné v ultrafialové nebo viditelné oblasti spektra: pro měření reflektance nebo transmitance fotometr se zdrojem světla, optické zařízení schopné generovat monochromatické světlo a fotoelektrický článek odpovídající citlivosti; pro měření fluorescence kromě toho monochromatický filtr pro vyčlenění určité spektrální oblasti emitovaného záření,
• pro látky obsahující radionuklidy: vhodné zařízení pro měření radioaktivity, u kterého je ověřena oblast linearity.
  

Postup. Předepsaným způsobem se připraví zkoušený roztok a, je-li třeba, připraví se i porovnávací roztoky stanovované látky ve stejném rozpouštědle jako zkoušený roztok. Nanesou se stejné objemy všech připravených roztoků a chromatogram se vyvíjí.

Látky detegovatelné v ultrafialové a viditelné oblasti spektra. Připraví se a nanesou se nejméně tři porovnávací roztoky, v nichž jsou koncentrace zkoušené látky v rozpětí jejího očekávaného obsahu ve zkoušeném roztoku (asi 80 %, 100 % a 120 %). Po skončeném vyvíjení se postříká, je-li třeba, předepsaným činidlem a zaznamená se reflektance, transmitance nebo fluorescence chromatogramů zkoušeného roztoku a porovnávacích roztoků. Naměřené hodnoty se použij í pro výpočet množství látky ve zkoušeném roztoku.

Látky obsahující radionuklidy. Připraví se a nanese se zkoušený roztok, jehož koncentrace je asi 100 % očekávané hodnoty. Radioaktivita se stanoví jako funkce délky dráhy a radioaktivity každého výsledného píku a vyjádří se jako procento z celkového množství radioaktivity. Kritéria pro posouzení způsobilosti systému jsou popsána ve stati chromatografické separační metody (2.2.46). Rozsah, ve kterém se mohou pohybovat jednotlivé parametry chromatografického systému tak, aby byla splněna kritéria způsobilosti systému, je rovněž uveden v této stati.