2.2.29   Kapalinová chromatografie

2001

Kapalinová chromatografie (LC) je separační metoda založená na Rozdílu v distribuci látek mezi dvě nemísitelné fáze, z nichž mobilní fází je kapalina, která prostupuje stacionární fází naplněnou do kolony.

LC je založena zejména na mechanismu adsorpce, rozdělování, výměny iontů, vylučování nebo stereochemických interakcích.

Přístroj

Přistroj se skládá z čerpacího systému, dávkovacího zařízení, chromatografické kolony (může být použit i regulátor teploty kolony), detektoru a zařízení na zpracování dat (nebo integrátoru či zapisovače). Mobilní fáze je do systému přiváděna z jednoho nebo více zásobníků a protéká obvykle konstantní rychlostí kolonou a poté detektorem.

Čerpací systémy

LC čerpací systémy jsou potřebné pro přivádění mobilní fáze konstantní průtokovou rychlostí. Kolísání tlaku má být co nejmenší, čehož se dosahuje např. průchodem tlakovaného rozpouštědla zařízením na tlumení pulzů. hadičky a všechny spoje musí být schopny odolat tlaku vyvinutému čerpacím systémem. k čerpací systémy mohou být vybaveny zařízením pro odstranění uvolněných bublin vzduchu.

Systémy ovládané mikroprocesory jsou schopny přesně přivádět mobilní fázi bud' s konstantním složením (izokratická eluce), nebo se složením, které se mění podle předem daného programu (gradientová eluce). V případě gradientové eluce se používají čerpací systémy, které dodávají rozpouštědlo či rozpouštědla z více zásobníků a mísení rozpouštědel se dosahuje bud' před natlakováním, nebo v tlakované části čerpadla nebo čerpadel.

Dávkovací zařízení

Roztok vzorku se dávkuje do protékající mobilní fáze na horní konec kolony nebo blízko něj pomocí dávkovacího zařízení, které je schopno pracovat při vysokém tlaku. Používají se zařízení s dávkovací smyčkou o konstantním nebo proměnném objemu pro ruční nebo automatické dávkovače. Ruční dávkování s částečně naplněnou smyčkou může způsobit horší přesnost nastřikovaného objemu.

Stacionární fáze

V k se používá mnoho typů stacionámích fází, jako jsou:

• silikagel, oxid hlinitý nebo porézní grafit používané v chromatografii s normálními fázemi, kde je separace založena na rozdílech v adsorpci alnebo rozdělování,
• pryskyřice nebo polymery s kyselými nebo zásaditými skupinami používané v iontoměničové chromatografii, kde je separace založena na konkurenci iontů, které mají být odděleny, a iontů, které jsou obsaženy v mobilní fázi,
• porézní silikagel nebo polymery používané ve vylučovací chromatografii, kde separace je založena na rozdffech v objemech molekul,
• různé druhy chemicky modifikovaných nosičů připravených z polymerů, silikagelu nebo porézního grafitu používané v chromatografii s obrácenými fázemi, kde je separace založena hlavně na rozdělování molekul mezi mobilní a stacionární fázi,
• speciální chemicky modifikované stacionární fáze, např. deriváty celulosy nebo amylosy, bílkoviny nebo peptidy, cyklodextriny atd. používané pro separaci enantiomerů (chirální chromatografie).

Většina separací je založena na mechanismu rozdělování a využívá chemicky modifikovaný silikagel jako stacionárnífázi a polární rozpouštědlo jako mobilní fázi. Povrch nosiče, např. silanolové skupiny silikagelu, se upravuje reakcí s různými silanizačními činidly za vzniku kovalentně vázaných silylových derivátů, které pokrývají proměnlivé množství aktivních míst na nosiči. Povaha vázané fáze je důležitým parametrem pro stanovení separačních vlastností chromatografického systému.

Běžně užívané vázané fáze jsou uvedeny níže:

Pokud není výrobcem uvedeno jinak, předpokládá se, že kolony pro chromatografii s obrácenými fázemi s náplní na bázi silikagelu jsou stabilní v mobilních fázích o zdánlivém pH 2,0 až 8,0. Kolony plněné porézním grafitem nebo částicemi polymerních materiálů jako je styrendivinylbenzen-kopolymer, jsou stabilní v širším rozsahu pH.

V některých případech je vhodná chromatografe s normálními fázemi, která využívá jako Stacionární fázi nemodifikovaný silikagel, porézní grafit nebo polárními skupinami chemicky modifikovaný silikagel, např. se skupinami kyanpropylovými nebo diolovým, v kombinaci s nepolární mobilní fázi.

Pro analytické separace se běžně používají stacionární fáze, které mají velikost částic 3 μm až 10 μm. Částice mohou mít sférický nebo nepravidelný tvar, různou porozitu a specifický povrch. Tyto parametry přispívají k chromatografickému chování jednotlivých stacionárních fází. V případě obrácených fází jsou doplňujícími charakteristikami Stacionární fáze její druh, stupeň navázání vyjádřený např. jako obsah vázaného uhlíku, údaj o případném odstranění povrchových silanolových skupin. Jestliže Stacionární fáze obsahuje zbytkové povrchové silanolové skupiny, mohou analyzované látky, zejména bazické, vykazovat chvostování píků.

V analytické chromatografii se používají kolony vyrobené z nerezové oceli, pokud není v článku uvedeno jinak. Mají různé délky a vnitřní průměry. Kolony s vnitřním průměrem menším než 2 mm jsou často označovány jako mikrokolony. Během analýzy musí být udržována konstantní teplota mobilní fáze a kolony. Většina separací se provádí při pokojové teplotě, ale kolony mohou být také zahřívány na vyšší teplotu pro dosažení vyšší účinnosti. Doporučuje se, aby kolony nebyly zahřívány na teplotu vyšší než 60 °C vzhledem k nebezpečí degradace
stacionární fáze nebo změn ve složení mobilní fáze.

Mobilní fáze

V chromatografii s normálními fázemi se používají méně polární mobilní fáze. Aby se dosáhlo reprodukovatelných výsledků, je nutné přísně kontrolovat přítomnost vody v mobilní fázi. V chromatografii s obrácenými fázemi se používají vodné mobilní fáze jak s organickým rozpouštědlem, tak bez něj.

Složky mobilní fáze se obvykle filtrují, aby z nich byly odstraněny částice větší než 0,45 μm. Vícesložkové mobilní fáze se připravují odměřením požadovaných objemů (pokud nejsou předepsány hmotnosti) jednotlivých složek a jejich smícháním. Jinou možností je přivádět rozpouštědla pomocí jednotlivých čerpadel ovládaných ventily, které umožňují míchání složek v požadovaném poměru. Rozpouštědla jsou před čerpáním do systému obyčejně odplyňována probubláváním heliem, v ultrazvukové lázni nebo se používají membránová či vakuová zařízení zařazená přímo do systému, která zabraňují tvorbě bublin v detektoru.

Rozpouštědla pro přípravu mobilní fáze obyčejně neobsahují stabilizátory a jsou propustná pro vlnovou délku používanou při detekci v ultrafialové oblasti spektra. Používaná rozpouštědla a jiné složky mobilní fáze mají mít vhodnou kvalitu. Pokud je nutné nastavení pH, provádí se pouze s vodnou částí mobilní fáze, nikoli s celou směsí. Jestliže se používají tlumivé roztoky, systém se po dokončení chromatografických analýz patřičně promyje směsí vody a organického rozpouštědla použitého v mobilní fázi (5 % (V/V)), aby se zabránilo krystalizaci solí.

Mobilní fáze mohou obsahovat další složky, např. protiionty u chromatografie iontových párů nebo chirální selektor v případě chromatografie s achirální stacionární fází.

Detektory

Nejběžněji používanými detektory jsou spektrofotometry pro měření v ultrafialové a viditelné oblasti (UVNis), včetně detektorů s diodovým polem. Mohou být také použity fluorescenční spektrofotometry, diferenční refraktometry, elektrochemické detektory, hmotnostní spektrometry, detektory na bázi rozptylu světla nebo měření radioaktivity a jiné speciální detektory.

Pracovní postup

S předepsanou mobilní fází a s průtokovou rychlostí se při pokojové teplotě nebo teplotě stanovené v lékopisném článku uvede kolona do rovnováhy, při níž je dosaženo stability základní linie.

Připraví se roztok či roztoky zkoušené látky a porovnávací roztok nebo roztoky. Roztoky nesmí obsahovat pevné částice.

Kritéria pro posouzení vhodnosti systému jsou popsána ve stati chromatografické separační metody (2.2.46). V této stati je také uveden rozsah, v němž mohou být nastaveny parametry chromatografického systému, aby se splnily požadavky testu způsobilosti.