2.2.30   Vylučovací chromatografie

2001

Vylučovací chromatografie je separační metoda, která rozděluje molekuly podle jejich velikostí. Pokud se používá organická mobilní fáze, je metoda známa jako gelová chromatografie, používá-li se vodná mobilní fáze, nazývá se tato metoda gelová filtrace.

Vzorek se vnáší na kolonu, která je naplněna gelem nebo náplní tvořenou porézními částicemi a je unášen mobilní fází. K dělení podle velikostí molekul dochází opakovanou výměnou molekul rozpuštěných látek mezi rozpouštědlem v mobilní fázi a stejným rozpouštědlem v nepohyblivé (stagnantní) kapalné fázi uvnitř pórů náplně (stacionární fáze). Rozmezí velikostí pórů náplně určuje rozmezí velikostí molekul, pro nějž lze dosáhnout separace.

Molekuly, které jsou tak malé, že mohou proniknout do všech pórů, jsou eluovány celkovým permeačním objemem (V_t). Naproti tomu molekuly větší než největší póry náplně migrují kolonou pouze v prostoru mezi částicemi náplně, aniž by byly jakkoliv zadržovány, a jsou eluovány vylučovacím objemem (V₀ neboli mrtvý objem). K separaci podle velikostí molekul dochází mezi vylučovacím a celkovým permeačním objemem, přičemž použitelného dělení se obvykle dosahuje v prvních dvou třetinách tohoto rozmezí.

Zařízení. Základem zařízení je chromatografická kolona různé délky a vnitřního průměru, v případě potřeby termostatovaná, naplněná separačním materiálem schopným dělení v příslušném rozsahu velikostí molekul, kterou protéká eluent konstantní rychlostí. Jeden konec kolony je obvykle připojen ke vhodnému zařízení pro nástřik vzorku, jako je průtokový adaptér, dávkovač se septem nebo dávkovací smyčka, a může být také připojen ke vhodnému čerpadlu pro regulaci průtoku eluentu. Případně může být vzorek nastřikován přímo na povrch náplně kolony zbavený kapaliny, nebo je-li vzorek hustší než eluent, může být navrstven pod eluent. Výstup z kolonyje obvykle připojen k vhodnému detektoru spojenému s automatickým zapisovačem, který umožňuje záznam relativních koncentrací separovaných složek vzorku. Detektory obvykle využívají fotometrické, refraktometrické nebo luminiscenční vlastnosti. V případě potřeby může být připojen automatický sběrač frakcí.

Náplní může být měkký nosič, jako je nabobtnalý gel, nebo tuhý nosič tvořený sklem, silikagelem nebo zesíťovaným organickým polymerem kompatibilním s rozpouštědlem. Tuhé nosiče obvykle vyžadují tlakované systémy, umožňující rychlejší separace. Mobilní fáze je volena podle typu vzorku, separačního prostředí a způsobu detekce. Před provedením separace se náplň upraví a naplní do kolony tak, jakje popsáno v článku nebo podle návodu výrobce.

Kritéria pro posouzení vhodnosti systému jsou popsána ve stati chromatografické separační metody (2.2.46). V této stati je uveden rozsah, v němž mohou být nastaveny parametry chromatografického systému, aby byly splněny požadavky testu způsobilosti.

Stanovení relativního zastoupení složek ve směsích

Provede se separace podle lékopisného článku. Pokud je to možné, zaznamenává se plynule eluce složek a měří se odpovídající plochy píků. Jestliže se separace složek vzorku zaznamenává prostřednictvím fyzikálně-chemické vlastnosti, k níž všechny sledované složky přispívají ekvivalentními odezvami (např. všechny složky mají stejnou specifickou absorbanci), vypočte se relativní množství každé složky tak, že se plocha píku dané složky dělí součtem ploch píků všech sledovaných složek. Jestliže se tyto odezvy u jednotlivých složek liší, vypočte se obsah za pomoci kalibračních křivek získaných s kalibračními standardy, které jsou předepsány v lékopisném článku.

Stanovení molekulových hmotností

Vylučovací chromatografie může být použita pro stanovení molekulových hmotností porovnáním s vhodnými kalibračními standardy, které jsou předepsány v lékopisném článku. Retenční objemy kalibračních standardů se vynášejí v závislosti na logaritmu molekulových hmotností těchto standardů. Graf se obvykle blíží přímce v oblasti mezi vylučovacím objemem a celkovým permeačním objemem pro použité separační prostředí. Z kalibrační křivky se stanoví molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka pro molekulové hmotnosti platí pouze pro daný systém makromolekulární látka - rozpouštědlo, který byl použit za předepsaných experimentálních podmínek.

Stanovení distribuce velikosti molekul polymerů

Vylučovací chromatografie může být použita pro stanovení distribuce velikostí molekul polymerů. Porovnání vzorků je však platné pouze v případě, že jsou výsledky získány za stejných experimentálních podmínek. Porovnávací látky použité pro kalibraci a metody stanovení distribuce velikosti molekul jsou uvedeny v daném lékopisném článku.