Český lékopis 1997

2.2.39 Stanovení distribuce molekulových hmotností v dextranu

Distribuce (zastoupení) jednotlivých molekulových hmotností v dextranu se stanoví metodou vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 0,200 g zkoušené látky se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10 ml.

Značkovací roztok. 5 mg glukosy R a 2 mg dextranu V0 CRL se rozpustí v 1 ml mobilní fáze.

Kalibrační roztoky. Odděleně se rozpustí vždy v 1 ml mobilní fáze 15 mg kalibračního dextranu 4 CRL, 15 mg kalibračního dextranu 10 CRL, 20 mg kalibračního dextranu 40 CRL, 20 mg kalibračního dextranu 70 CRL a 20 mg kalibračního dextranu 250 CRL.

Roztok pro test způsobilosti systému. Rozpustí se buď 20 mg testovacího dextranu 40 CRL (pro dextran 40), nebo 20 mg testovacího dextranu 60/70 CRL (pro dextran 60 a dextran 70) v 1 ml mobilní fáze.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

Teplota systému se udržuje konstantní (±0,1 °C).

Kalibrace chromatografického systému. Nastříkne se opakovaně zvolený objem značkovacího roztoku. Chromatogram ukáže dva píky, z nichž první odpovídá dextranu V0 CRL a druhý glukose R. Z elučního objemu píku dextranu V0 se počítá volný objem V0 a z elučního objemu píku glukosy se spočítá celkový objem Vi.

>Nastříkne se zvolený objem každého z kalibračních roztoků. Zakresli se pečlivě záklaďní linie všech chromatogramů. Každý chromatogram se rozdělí na p (nejméně šedesát) stejně velkých vertikálních úseků (odpovídajících stejným elučním objemům). V každém úseku i odpovídajícím elučnímu objemu Vi se změří výška linie chromatogramu y nad základní linií a vypočítá se distribuční koeficient Ki za použití výrazu:

   (Vi - V0 (1)
(Vt - V0)

V němž značí:

V0 - volný objem kolony stanovený pomocí píku dextranu V0 CRL na chromatogramu značkovacího roztoku,

Vt - celkový objem kolony stanovený pomocí píku glukosy R na chromatogramu značkovacího roztoku,

Vi - eluční objem úseku i na chromatogramu jednotlivých kalibračních roztoků.

Provede se kalibrace za použití některé z následujících metod.

Kalibrace grafická. S použitím výrazu (1) se vypočítá pro každý kalibrační dextran CRL distribuční koeficient KMAX odpovídající maximální výšce linie chromatogramu. Hodnoty KMAX se vynesou do grafu na semilogaritmický papír (na osu x) proti deklarované molekulové hmotnosti odpovídající maximální výšce linie chromatogramu (MMAX) každého z kalibračních dextranů a glukosy. Získanými body se proloží první kalibrační křivka, přičemž se extrapoluje z bodu KMAX vypočítaného pro kalibrační dextran 250 CRL k nejnižší vypočítané hodnotě K získané pro tento CRL, (viz obr. 2.2.39-1). S využitím této první kalibrační křivky se pro každý chromatogram transformují všechny hodnoý Ki na odpovídající molekulové hmotnosti Mi, čímž se získá distribuce molekulových hmotností. Pro každý kalibrační dextran se pomocí rovnice (3) uvedené níže vypočítá průměrná molekulová hmotnost Mw. Jestliže se vypočítané hodnoty Mw neliší o více než 5% od hodnot deklarovaných pro každý kalibrační dextran a průměrný rozdíl je v rozmezí ±3 %, kalibrační křivka může být použita pro stanovení distribuce molekulových hmotností. V opačném případě se výše popsaný postup opakuje, až se vypočítané a deklarované hodnoty Mw neliší o více než 5 %.

Kalibrace výpočtem křivky. Z rovnic (2) a (3) uvedených níže se použitím vhodné metody* vypočítají hodnoty pro b1, b2, b3, b4 a b5 tak, aby se hodnoty Mw, pro kalibrační dextrany lišily nejvýše o 5 % od hodnot deklarovaných a Mw glukosy činila 180 ± 2:

Mt = b5 + e(b4 + b1K2t + b3K3t) (2)

Mw = p (3)
 (yiMi)
i-1
p
 yi
i-1

kde značí:

p - počet úseků dělících chromatogramy,

yi - výšku chromatograficlcé linie nad základní linií v úseku i,

Mi - molekulovou hmotnost v úseku i.

Zkouška způsobilosti systému. Nastříkne se zvolený objem roztoku pro zkoušku způsobilosti systému.

Průměrná molekulová hmotnost testovacího dextranu CRL. Vypočítá se průměrná molekulová hmotnost Mw způsobem popsaným v odstavci "Kalibrace chromatograficlcého systému" za použití buď kalibrační křivky, nebo hodnot b1, b2, b3, b4 a b5, získaných výše uvedeným způsobem.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že Mw je:

Obr. 2.2.39-1 Příklad kalibrační křivky

Tečkovaná čára odpovídá extrapolované části křivky. Vodorovné přímky ve spodní části obrázku znázorňují šířku a polohu chromatografické linie každého z kalibračních dextranů.

Průměrná molekulová hmotnost 10% vysoké frakce dextranu. Pro 10% vysokou frakci dextranu eluovanou v úseku chromatogramu n se vypočítá Mw podle vzorce:

Mw = n (4)
 (yiMi)
i-1
n
 yi
i-1

kde n je dáno výrazy:

   n (  p ) (5)
yi ≤ 0,1 * yi
i-1 i-1

  n+1 (  p ) (6)
yi > 0,1 * yi
i-1 i-1

V nichž značí:

p - počet úseků dělících chromatogram,

yi - výšku linie chromatogramu nad základní linií v úseku i

Mi - molekulovou hmotnost v úseku i.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že Mw je:

Průměrná molekulová hmotnost 10% nízké frakce dextranu. Pro 10% nízkou frakci dextranu eluovanou v úseku m a před ním se vypočítá Mw podle vzorce:

Mw =  p (7)
(yiMi)
i-m
 p
yi
i-m

kde m je dáno výrazy:

   p (  p ) (8)
yi ≤ 0,1 * yi
i-m i-1

   p (  p ) (9)
yi > 0,1 * yi
i-m-1 i-1

V nichž značí:

p - počet úseků dělících chromatogramy,

yi - výšku linie chromatogramu nad základní linií v úseku i,

Mi - molekulovou hmotnost v úseku i.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že Mw 10% nízké frakce dextranu je:

Distribuce molekulových hmotností zkoušeného dextranu. Nastříkne se zvolený objem zkoušeného roztoku a vypočítají se Mw pro celkovou distribuci molekulových hmotností, Mw pro 10% vysokou frakci dextranu a Mw pro 10% nízkou frakci dextranu způsobem popsaným v odstavci "Zkouška způsobilosti systému".


* Je vhodná iterační metoda Gaussova-Newtonova modifikovaná Hartleyem (Hartley, O.: Tecnometrics, 3,1961 a Nilsson, G., Nilsson, K.: J. Chromat., 101,1974,137 nejlépe ve spojení s programem pro nelineární regresi.