Lékopis - Stanovení distribuce molekulových hmotností v dextranu

Český lékopis 1997

2.2.39 Stanovení distribuce molekulových hmotností v dextranu

Distribuce (zastoupení) jednotlivých molekulových hmotností v dextranu se stanoví metodou vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 0,200 g zkoušené látky se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10 ml.

Značkovací roztok. 5 mg glukosy R a 2 mg dextranu V₀ CRL se rozpustí v 1 ml mobilní fáze.

Kalibrační roztoky. Odděleně se rozpustí vždy v 1 ml mobilní fáze 15 mg kalibračního dextranu 4 CRL, 15 mg kalibračního dextranu 10 CRL, 20 mg kalibračního dextranu 40 CRL, 20 mg kalibračního dextranu 70 CRL a 20 mg kalibračního dextranu 250 CRL.

Roztok pro test způsobilosti systému. Rozpustí se buď 20 mg testovacího dextranu 40 CRL (pro dextran 40), nebo 20 mg testovacího dextranu 60/70 CRL (pro dextran 60 a dextran 70) v 1 ml mobilní fáze.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru 10 mm, naplněné agarosou síťovanou pro chromatografii R, nebo do série spojených kolon délky 0,3 m a vnitřního průměru 10 mm naplněných gelem hydroxylovaného polyetheru pro chromatografii R,
mobilní fáze připravené ze 7 g síranu sodného bezvodého R a 1 g chlorbutanolu R v 1 l vody R při průtokové rychlosti 0,5 ml/min až 1,0 ml/min udržované v konstantním rozmezí ±1 %/h,
diferenčního refraktometru jako detektoru,
dávkovacího zařízení se smyčkou 100 µl až 200 µl.

Teplota systému se udržuje konstantní (±0,1 °C).

Kalibrace chromatografického systému. Nastříkne se opakovaně zvolený objem značkovacího roztoku. Chromatogram ukáže dva píky, z nichž první odpovídá dextranu V₀ CRL a druhý glukose R. Z elučního objemu píku dextranu V₀ se počítá volný objem V₀ a z elučního objemu píku glukosy se spočítá celkový objem V_i.

>Nastříkne se zvolený objem každého z kalibračních roztoků. Zakresli se pečlivě záklaďní linie všech chromatogramů. Každý chromatogram se rozdělí na p (nejméně šedesát) stejně velkých vertikálních úseků (odpovídajících stejným elučním objemům). V každém úseku i odpovídajícím elučnímu objemu V_i se změří výška linie chromatogramu y nad základní linií a vypočítá se distribuční koeficient K_i za použití výrazu:

	(V_i - V₀)	(1)
	(V_t - V₀)

V němž značí:

V₀ - volný objem kolony stanovený pomocí píku dextranu V₀ CRL na chromatogramu značkovacího roztoku,

V_t - celkový objem kolony stanovený pomocí píku glukosy R na chromatogramu značkovacího roztoku,

V_i - eluční objem úseku i na chromatogramu jednotlivých kalibračních roztoků.

Provede se kalibrace za použití některé z následujících metod.

Kalibrace grafická. S použitím výrazu (1) se vypočítá pro každý kalibrační dextran CRL distribuční koeficient K_MAX odpovídající maximální výšce linie chromatogramu. Hodnoty K_MAX se vynesou do grafu na semilogaritmický papír (na osu x) proti deklarované molekulové hmotnosti odpovídající maximální výšce linie chromatogramu (M_MAX) každého z kalibračních dextranů a glukosy. Získanými body se proloží první kalibrační křivka, přičemž se extrapoluje z bodu K_MAX vypočítaného pro kalibrační dextran 250 CRL k nejnižší vypočítané hodnotě K získané pro tento CRL, (viz obr. 2.2.39-1). S využitím této první kalibrační křivky se pro každý chromatogram transformují všechny hodnoý K_i na odpovídající molekulové hmotnosti M_i, čímž se získá distribuce molekulových hmotností. Pro každý kalibrační dextran se pomocí rovnice (3) uvedené níže vypočítá průměrná molekulová hmotnost M_w. Jestliže se vypočítané hodnoty M_w neliší o více než 5% od hodnot deklarovaných pro každý kalibrační dextran a průměrný rozdíl je v rozmezí ±3 %, kalibrační křivka může být použita pro stanovení distribuce molekulových hmotností. V opačném případě se výše popsaný postup opakuje, až se vypočítané a deklarované hodnoty M_w neliší o více než 5 %.

Kalibrace výpočtem křivky. Z rovnic (2) a (3) uvedených níže se použitím vhodné metody^* vypočítají hodnoty pro b₁, b₂, b₃, b₄ a b₅ tak, aby se hodnoty M_w, pro kalibrační dextrany lišily nejvýše o 5 % od hodnot deklarovaných a M_w glukosy činila 180 ± 2:

M_t = b₅ + e^{(b₄ + b₁K²_t + b₃K³_t)}

(2)

M_w =	p	(3)
	∑ (y_iM_i)
	i-1
	p
	∑ y_i
	i-1

kde značí:

p - počet úseků dělících chromatogramy,

y_i - výšku chromatograficlcé linie nad základní linií v úseku i,

M_i - molekulovou hmotnost v úseku i.

Zkouška způsobilosti systému. Nastříkne se zvolený objem roztoku pro zkoušku způsobilosti systému.

Průměrná molekulová hmotnost testovacího dextranu CRL. Vypočítá se průměrná molekulová hmotnost M_w způsobem popsaným v odstavci "Kalibrace chromatograficlcého systému" za použití buď kalibrační křivky, nebo hodnot b₁, b₂, b₃, b₄ a b₅, získaných výše uvedeným způsobem.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že M_w je:

41 000 až 47 000 (testovací dextran 40 CRL),
67 000 až 75 000 (testovací dextran 60/70 CRL).

Obr. 2.2.39-1 Příklad kalibrační křivky

Tečkovaná čára odpovídá extrapolované části křivky. Vodorovné přímky ve spodní části obrázku znázorňují šířku a polohu chromatografické linie každého z kalibračních dextranů.

Průměrná molekulová hmotnost 10% vysoké frakce dextranu. Pro 10% vysokou frakci dextranu eluovanou v úseku chromatogramu n se vypočítá M_w podle vzorce:

M_w =	n	(4)
	∑ (y_iM_i)
	i-1
	n
	∑ y_i
	i-1

kde n je dáno výrazy:

n	(	p	)	(5)
∑y_i ≤ 0,1 *		∑y_i
i-1		i-1

n+1	(	p	)	(6)
∑y_i > 0,1 *		∑y_i
i-1		i-1

V nichž značí:

p - počet úseků dělících chromatogram,

y_i - výšku linie chromatogramu nad základní linií v úseku i

M_i - molekulovou hmotnost v úseku i.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že M_w je:

110 000 až 130 000 (testovací dextran 40 CRL),
190 000 až 230 000 (testovací dextran 60/70 CRL).

Průměrná molekulová hmotnost 10% nízké frakce dextranu. Pro 10% nízkou frakci dextranu eluovanou v úseku m a před ním se vypočítá M_w podle vzorce:

M_w =	p	(7)
	∑(y_iM_i)
	i-m
	p
	∑y_i
	i-m

kde m je dáno výrazy:

p	(	p	)	(8)
∑y_i ≤ 0,1 *		∑y_i
i-m		i-1

p	(	p	)	(9)
∑y_i > 0,1 *		∑y_i
i-m-1		i-1

V nichž značí:

p - počet úseků dělících chromatogramy,

y_i - výšku linie chromatogramu nad základní linií v úseku i,

M_i - molekulovou hmotnost v úseku i.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že M_w 10% nízké frakce dextranu je:

6000 až 8500 (testovací dextran 40 CRL),
7000 až 11 000 (testovací dextran 60/70 CRL).

Distribuce molekulových hmotností zkoušeného dextranu. Nastříkne se zvolený objem zkoušeného roztoku a vypočítají se M_w pro celkovou distribuci molekulových hmotností, M_w pro 10% vysokou frakci dextranu a M_w pro 10% nízkou frakci dextranu způsobem popsaným v odstavci "Zkouška způsobilosti systému".

^* Je vhodná iterační metoda Gaussova-Newtonova modifikovaná Hartleyem (Hartley, O.: Tecnometrics, 3,1961 a Nilsson, G., Nilsson, K.: J. Chromat., 101,1974,137 nejlépe ve spojení s programem pro nelineární regresi.