Lékopis - Chromatografické separační metody

Český lékopis 1997

2.2.46 Chromatografické separační metody

2001

Chromatografické separační metody jsou vícestupňové separační metody, kde složky vzorku jsou rozdělovány mezi dvě fáze, z nichž jedna je stacionární a druhá je mobilní. Stacionární fází může být pevná látka nebo kapalina nanesená na tuhý nosič nebo gel. Stacionární fáze může být naplněna do kolon, rovnoměrně rozprostřena do vrstvy nebo filmu atd. Mobilní fáze může být plynná, kapalná nebo kapalina v superkritickém stavu. Separace může být založena na adsorpci, rozdělování, výměně iontů atd., nebo může být založena na rozdílech ve fyzikálně-chemických vlastnostech molekul, jako je velikost, hmotnost, objem atd.

Tato kapitola obsahuje definice a výpočty společných parametrů a obecné požadavky pro způsobilost systému. Principy separace, přístroje a metody jsou pak uvedeny v dalších obecných statích věnovaných jednotlivým separačním metodám:

Papírová chromatografie (2.2.26)
Tenkovrstvá chromatografie (2.2.27)
Plynová chromatografie (2.2.28)
Kapalinová chromatografie (2.2.29)
Vylučovací chromatografie (2.2.30)
Superkritická fluidní chromatografie (2.2.45)

Definice

Následující definice jsou použity pro výpočet limitů v lékopisných článcích.

U některých přístrojů mohou být určité parametry, např. poměr signálu k šumu, vypočítány za použiti softwaru dodaného výrobcem přístroje. Je odpovědností uživatele zajistit, aby metody použité v softwarovém vybavení byly slučitelné s lékopisnými požadavky. Pokud tomu tak není, musí být provedeny nezbytné korekce.

Chromatogram

Chromatogram představuje grafický nebo jiný záznam odezvy detektoru, koncentrace eluované látky nebo jiné veličiny použité jako měřítko této koncentrace v závislosti na čase, objemu nebo vzdálenosti. Idealizovaný chromatogram představuje řada gaussovských píků na základní linii.

RETENČNÍ DATA
Retenční čas a retenční objem

Měření retence v eluční chromatografii může být vyjádřeno retenčním časem (t_R), přímo definovaným polohou vrcholu píku na chromatogramu. Z retenčního času může být vypočítán retenční objem (V_R) podle vztahu:

V_R = t_Rv ,

v němž značí:
t_R - retenční čas nebo vzdálenost podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce,
v - průtokovou rychlost mobilní fáze.

Hmotnostní distribuční poměr (známý jako kapacitní faktor k´nebo retenční faktor)

Hmotnostní distribuční poměr (D_m) je definován jako:

D_m=	množství rozpuštěné látky ve stacionární fázi	= k_c	V_s
	množství rozpuštěné látky v mobilní fázi		V_M

v němž značí:

k_C - rovnovážný distribuční koeficient (známý jako distribuční konstanta),
V_S - objem stacionární fáze,
V_M - objem mobilní fáze.

Hmotnostní distribuční poměr složky může být určen z chromatogramu s použitím výrazu:

D_m=	t_R- t_M
	t_M

v němž značí:

t_R - retenční čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce,
t_M - mrtvý čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce.

Distribuční koeficient

Eluční charakteristika látky na určité koloně ve vylučovací chromatografii může být dána distribučním koeficientem (K₀), který se vypočítá ze vzorce:

K₀=	t_R-t₀
	t_t-t₀

v němž značí:
t_R - retenční čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce,
t₀ - mrtvý čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce.
t_t - retenční čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího složce, která může volně pronikat do všech pórů stacionární fáze.

Retenční faktor

Retenční faktor (R_F) (známý též jako retardační faktor R_f) používaný v planátní chromatografii, je poměr vzdálenosti od startu ke středu skvrny a vzdálenosti, kterou od startu urazilo čelo rozpouštědla.

R_F=	b
	a

v němž značí:
b - migrační vzdálenost stanovované látky,
a - migrační vzdálenost čela rozpouštědla.

CHROMATOGRAFICKÁ DATA

Pík může být definován plochou píku (A) nebo výškou píku (h) a šířkou píku v poloviční výšce (w_h) nebo výškou píku (h) a šířkou piku mezi body inflexe (w_i). Pro gaussovské píky (obr. 2.2.46-1) platí vztah:

w_h =1,18w_i ,

Obr. 2.2.46-1

Faktor symetrie

Faktor symetrie píku (A_S) (nebo faktor chvostování píku) (obr. 2.2.46-2) se vypočítá ze vzorce:

A_S=	w_0.05
	2d

v němž značí:
w_0,05 - šířku píku v jedné dvacetině jeho výšky,
d - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky. Hodnota faktoru symetrie 1,0 značí úplnou (ideální) symetrii píku.

Obr. 2.2.46-2

Účinnost kolony a zdánlivý počet teoretických pater

Účinnost kolony (zdánlivá) může být vypočtena jako zdánlivý počet teoretických pater (N) z dat získaných v závislosti na technice za podmínek izotermických, izokratických nebo izopyknických. Použije se následující vzorec, v němž hodnoty t_R a w_h, musí být vyjádřeny ve stejných jednotkách (času, objemu nebo vzdálenosti):

N = 5,54( t-" 1z l wh

v němž značí:
t_R- retenční čas nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce,
w_h, - šířku píku v polovině jeho výšky.

Zdánlivý počet teoretických pater se mění se stanovovanou složkou, kolonou a retenčním časem.

SEPARAČNÍ DATA

Rozlišení

Rozlišení (R_s) mezi píky dvou složek, které mají podobnou výšku, může být vypočteno ze vzorce:

R_S=	1,18(t_R2-t_R1)	kde t_R2>t_R1,
R_S=	W_h1+W_h2

v němž značí:
t_R1 a t_R2 - retenční časy nebo vzdálenosti podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmicím spuštěným dvou sousedních píků,
w_h1 a w_h2 - šířky píků v poloviční výšce.

Rozlišení větší než 1,5 odpovídá rozdělení píků na základní linii.

Pro píky, které se vzájemně značně liší svými výškami, nemusí být výše uvedený vzorec vhodný.

V kvantitativní planární chromatografii jsou místo retenčních časů používány migrační vzdálenosti a a b a rozlišení může být vypočteno ze vzorce:

R_S=

1,18a(R_F2-R_F1)

Align=center>W_h1+W_h2

v němž značí:
R_F1a R_F2 - poměry vzdáleností od startu ke středům skvrn a vzdálenosti, kterou od startu urazilo čelo rozpouštědla,
w_h1 a w_h2- šířky píků v polovině jejich výšky,
a - migrační vzdálenost čela rozpouštědla.

Poměr výšky píku k sedlu

Jestliže není zcela oddělena nečistota od analyzované látky, lze použít poměr výšky píku k sedlu (p/v) jako kritérium pro způsobilost systému k dělení příbuzných látek (obr. 2.2.46-3).

p /v =	H_p
	H_v

v němž značí:
H_p - výšku píku nečistoty nad extrapolovanou základní linií,
H_v - výšku nejnižšího bodu křivky oddělující píky nečistoty a stanovované látky (sedlo) nad extrapolovanou základní linií.

Obr. 2.2.46-3

Relativní retence

Relativní retence (r) se vypočítá ze vzorce:

r =

t_R2-t_M

Align=center>t_R1-t_M

v němž značí:
t_R2 - retenční čas sledovaného píku,
t_R1 - retenční čas referenčního píku (obvykle pík odpovídající zkoušené látce),
t_M - mrtvý čas nebo vzdálenost podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce.

V planární chromatografii se používají retenční faktory R_F2 a R_F1 místo t_R2 a t_R1.

PŘESNOST KVANTITATIVNÍ ANALÝZY

Poměr signálu k šumu

Poměr signálu k šumu (S/N), který ovlivňuje přesnost stanovení obsahu složek, se vypočítá ze vzorce:

S/N =	2H
	h

v němž značí:
H - výšku píku (obr. 2.2.46-4) odpovídajícího dané látce na chromatogramu předepsaného porovnávacího roztoku měřené od vrcholu píku k extrapolované základní linii signálu, který se sleduje na vzdálenosti rovné dvacetinásobku šířky píku v polovině jeho výšky,
h - rozpětí šumu pozadí na chromatogramu získaného při slepé zkoušce a zaznamenávaného na vzdálenosti rovné dvacetinásobku šířky píku v polovině jeho výšky na chromatogramu předepsaného porovnávacího roztoku, a to pokud možno rovnoměrně na obě strany od místa, kde by se měl nacházet sledovaný pík.

Obr. 2.2.46-4

Opakovatelnost

Opakovatelnost odezvy se vyjadřuje jako odhad relativní směrodatné odchylky (RSD~) v procentech pro řadu následných měření porovnávacího roztoku a vypočítá se z výrazu:

RSD_% =	100	∑( y_i-y )²
RSD_% =	y	n-1

v němž značí:
y_i - jednotlivé hodnoty vyjádřené jako plocha píku, výška píku nebo poměr plochu metody vnitřního standardu,
ý - průměr jednotlirých hodnot,
n - počet jednotlivých hodnot.
Maximální dovolená relativní standardní odchylka (RSDmax) se vypočítá pro řadu nástřiků porovnávacího roztoku pro definované limity podle následujícího vzorce:

RSD_max =

KB √n

Align=center>t_{90%, n-1}

v němž značí:

K - konstantu (0,349) získanou ze vztahu:

K = 0.6 t_{90%, 5}

√ 2 √ 6
v němž

0.6

√ 2
představuje požadovanou RSD pro 6 nástřiků a pro B = 1,0,
B - horní limit daný v

Definici jednotlivých lékopisných článků minus 100 % za předpokladu, že horní limit je určen podle reprodukovatelnosti metody,
n - počet opakovaných nástřiků porovnávacího roztoku (3 ≤ n ≤ 6),
t_{90%, n-1} - Studentův parametr t při 90% pravděpodobnosti (oboustranný) pro n - 1 stupňů volnosti.

Způsobilost systému

Test způsobilosti systému představuje nedílnou součást metody a slouží k zajištění přiměřené účinnosti chromatografického systému. Pro hodnocení účinnosti kolony se používají následující parametry: zdánlivá účinnost, kapacitní faktor, rozlišení, relativní retence a faktor symetrie. Faktory, které mohou ovlivnit chromatografické chování, zahrnují složení mobilní fáze, její iontovou sílu, teplotu a zdánlivé pH, průtokovou rychlost, délku kolony, teplotu a tlak, charakteristiku stacionární fáze včetně porozity, velikostí a typu částic, specifického povrchu a u nosičů používaných v chromatografii s obrácenými fázemi rozsah chemické modifikace (odstranění povrchových silanolových skupin, obsah vázaného uhlíku atd.).

Jednotlivé části použitého zařízení musí být kvalifikovány a musí být schopny dosáhnout přesnosti požadované pro provedení zkoušky nebo stanovení obsahu.

Pokud není v

Lékopisném článku uvedeno jinak, musí být splněny následující požadavky:

faktor symetrie hlavního píku má být mezi 0,8 a 1,5, pokud není v lékopisném článku stanoveno jinak. Tento požadavek je obecně použitelný pro zkoušky na čistotu nebo stanovení obsahu popsané v lékopisných článcích,
maximální dovolená relativní směrodatná odchylka pro opakované nástřiky předepsaného porovnávacího roztoku nepřevyšuje hodnoty uvedené v tabulce 2.2.46-1. Tento požadavek je použitelný pouze pro stanovení obsahu,
mez detekce píku (odpovídající poměru signálu k šumu = 3) je pod limitem zanedbatelnosti píků (práh zaznamenávání píků) u zkoušky na příbuzné látky,
mez stanovitelnosti píku (odpovídající poměru signálu k šumu = 10) je nejvýše rovna limitu zanedbatelnosti píků u zkoušky na příbuzné látky.

Tab. 2.2.46-1 Požadavky na opakovatelnost

	Počet jednotlivých nástřiků
	3	4	5	6
B(%)	Maximální dovolená relativní směrodatná odchylka
1.0	0.21	0.30	0.37	0.42
1.5	0.31	0.44	0.55	0.64
2.0	0.41	0.59	0.73	0.85
2.5	0.52	0.74	0.92	1.06
3.0	0.62	0.89	1.10	1.27

ÚPRAVA CHROMATOGRAFICKÝCH PODMÍNEK

Pro informaci je níže uveden rozsah, v němž mohou být různé parametry chromatografické zkoušky upraveny tak, aby byla splněna kritéria způsobilosti systému, aniž by přitom došlo k podstatnému pozměnění metody. Popsané chromatografické podmínky byly validovány během vypracovávání lékopisného článku. V metodách jsou začleněny testy způsobilosti systému, aby se zajistila separace požadovaná pro uspokojivé provedení zkoušky na čistotu nebo stanovení obsahu. Protože použité stacionární fáze jsou popsány obecně a komerčně je k dispozici vždy celá řada takovýchto fází, lišících se navzájem chromatografickým chováním, může být určité upravení chromatografických podmínek nezbytné pro splnění předepsaných požadavků na způsobilost systému. Zejména u metod kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi se však upravením různých parametrů nedosáhne vždy uspokojivého dělení. V takovém případě pak může být nutné zaměnit kolonu za jinou kolonu stejného typu (např. silikagel s oktadecylsilanizovanými skupinami), ale od jiného výrobce, která bude vykazovat žádoucí chromatografické chování.

U kritických parametrů je jejich úprava jasně stanovena v lékopisném článku, aby se zajistila způsobilost systému. Je vhodné vyhnout se několikanásobnému upravování, které může mít kumulativní vliv na účinnost chromatografického systému.

Tenkovrstvá chromatografie a papírová chromatografie

Složení mobilni fáze. Množství minoritní složky rozpouštědla může být upraveno v rozmezí ±30 relativních procent nebo ±2 absolutní procenta, podle toho, která hodnota je větší. Žádná jiná složka se nemění o více než 10 absolutních procent.
pH vodné složky mobilni fáze. ±0,2 hodnoty pH, pokud není uvedeno jinak v lékopisném článku, nebo ±1,0 pH, když je zkoušená látka neutrální.
Koncentrace solí v tlumivém roztoku tvořícím součást mobilní fáze je možno upravovat v rozmezí ±10 %.
Nanášený objem lze snížit na 20 % předepsaného objemu, jestliže se používají desky s jemnými částicemi (2 μm až 10 μm).
Migrační vzdálenost čela rozpouštědla nemá být menší než 50 mm.

Kapalinová chromatografie

Složení mobilní fáze. Množství minoritní složky rozpouštědla může být upraveno v rozmezí ±30 relativních procent nebo ±2 absolutní procenta, podle toho, která hodnota je větší. Žádnou další složku nelze měnit o více než 10

Absolutních procent.
pH vodné složky mobilní fáze. ±0,2 hodnoty pH, pokud není uvedeno jinak v lékopisném článku, nebo ±1,0 hodnoty pH, když je zkoušená látka neutrální.
Koncentrace solí v tlumivém roztoku tvořícím součást mobilní fáze je možno upravovat v rozmezí ±10 %.
Vlnová délka detektoru. Není dovoleno žádné upravování.
Stacionární fáze:

délka kolony: ±70 %,
vnitřní průměr kolony: ±25 %,
velikost částic: zmenšení nejvýše o 50 %, zvětšení není dovoleno.

Průtoková rychlost. ±50 %.
Teplota. ±10 %, nejvýše však 60 °C.
Nastřikovaný objem může být zmenšen za předpokladu, že detekce píků a opakovatelnost stanovovaného píku (stanovovaných píků) je vyhovující.
Gradientová eluce. Konfigurace použitého zařízení může významně změnit rozlišení, retenční čas a relativní retence popsané v konkrétní metodě. To může být způsobeno zvětšeným mrtvým objemem, což je objem mezi vrškem kolony a bodem, v němž dochází ke smíchání dvou složek mobilní fáze.

Plynová chromatografie

Stacionární fáze:

délka kolony: ±70 %,
vnitřní průměr kolony: ±50 %,
velikost částic: zmenšení nejvýše o 50 %, zvětšení není dovoleno,
tloušťka filmu: -50 % až +100 %.

Průtoková rychlost. ±50 %.
Teplota. ±10 %.
Nastřikovaný objem může být zmenšen za předpokladu, že detekce a opakovatelnost je vyhovující.

Superkritická fluidní chromatografie

Složení mobilní Fáze. Pro náplňové kolony může být množství minoritní složky rozpouštědla upraveno v rozmezí ±30 relativních procent nebo ±2 absolutní procenta, podle toho, která hodnota je větší. Při použití kapilárních kolon není žádná úprava dovolena.
Vlnová délka detektoru. Není dovoleno žádné upravování.

Stacionární fáze:

délka kolony: ±70 %,
vnitřní průměr kolony: ±25 % (náplňové kolony), ±50 % (kapilární kolony),
velikost částic: zmenšení nejvýše o 50 %, zvětšení není dovoleno (plněné kolony).

Průtoková rychlost. ±50 %.
Teplota. ±10 %, nejvýše však 60 °C.
Nastřikovaný objem může být zmenšen za předpokladu, že detekce píků a opakovatelnost plochy píků je vyhovující.

Kvantitativní analýza

Metoda vnějšího standardu. Koncentrace stanovované složky (stanovovaných složek) se určí porovnáním odezvy píku (píků) složky (složek) naměřené pro zkoušený roztok a odpovídající odezvy naměřené pro porovnávací roztok. Metoda vnitřního standardu. Ke zkoušenému a porovnávacímu roztoku se přidají stejná množství látky (kterou zkoušený roztok neobsahuje), kterou lze rozlišit od zkoušené látky a která s ní nereaguje (vnitřní standard). Koncentrace zkoušené látky se stanoví porovnáním poměru ploch píků nebo výšek píků stanovované látky a vnitřního standardu pro zkoušený roztok a odpovídajícího poměru pro porovnávací roztok.
Metoda normalizace. Obsah jedné nebo více složek zkoušené látky v procentech se vypočítá z plochy nebo ploch jako procento celkové plochy všech píků s výjimkou píků rozpouštědel nebo přidaných reakčních činidel a píků, které jsou v limitu zanedbatelnosti píků.
Kalibrační postup. Stanoví se vztah mezi měřeným nebo vyhodnocovaným signálem (y) a množstvím (koncentrace, hmotnost, atd.) stanovované látky (x) a vypočítá se kalibrační funkce. Výsledky analýzy se vypočtou ze změřeného nebo vyhodnoceného signálu stanovované látky pomocí inverzní funkce.

Pro zkoušky na čistotu a stanovení obsahu složek může být v lékopisném článku předepsána metoda vnějšího standardu, vnitřního standardu nebo kalibrační postup.

Metoda normalizace není v tomto případě běžně používána. Ve zkouškách na příbuzné látky se obecně používá bud' metoda vnějšího standardu s jedním porovnávacím roztokem, nebo metoda normalizace. Jestliže je u metody normalizace nebo u metody vnějšího standardu používán pro porovnání zředěný roztok zkoušené látky, jsou odezvy příbuzných látek podobné odezvě účinné látky (odezvový faktor 0,8 až 1,2), jinak jsou uvedeny v textu korekční faktory (převrácená hodnota odezvového faktoru).

Odezvový faktor je poměrná hodnota, která je rovna odezvě jedné látky vztažené k odezvě stejného množství jiné látky za podmínek popsaných v textu.

Jestliže je ve zkoušce na příbuzné látky předepsáno sečítání nečistot nebo stanovení obsahu některé nečistoty, je důležité zvolit vhodné nastavení prahové hodnoty a vhodné podmínky pro integraci ploch píků. U takovýchto zkoušek je limit pro zanedbatelnost píků (např. hodnota plochy, kterou nejvýše mohou mít píky, k nimž se při hodnocení nepřihlíží) Obecně 0,05 %. Nastavení prahové hodnoty systému pro sběr dat odpovídá nejméně polovině tohoto limitu. Plochy píků nečistot, které nejsou úplně odděleny od hlavního píku, jsou přednostně integrovány za použití extrapolace sedlo - sedlo (tangenciální oddělení minoritního píku). Píky rozpouštědla nebo rozpouštědel použitých pro rozpuštění vzorku se rovněž zanedbávají.