2.2.47   Kapilární elektroforéza

2001

Obecné principy

Kapilární elektroforéza je fyzikální analytická metoda založená na migraci elektricky nabitých stanovovaných látek rozpuštěných v roztoku elektrolytu kapilárou vlivem stejnosměrného elektrického pole.

Migrační rychlost stanovované látky v elektrickém poli o intenzitě E je určena elektroforetickou pohyblivostí stanovované látky a elektroosmotickou pohyblivostí tlumivého roztoku v kapiláře. Elektroforetická pohyblivost rozpuštěné látky (μ_ep) závisí najejích vlastnostech (elektrický náboj, velikost a tvar molekuly) a na vlastnostech tlumivého roztoku, v němž migrace probíhá (typ a iontová síla roztoku elektrolytu, pH, viskozita, přísady). Elektroforetická rychlost (v_ep) rozpuštěné látky je za předpokladu kulového tvaru nabité molekuly dána rovnicí:

vep = μepE =		q		V
		6pηr		L

v níž značí:
q - efektivní náboj rozpuštěné látky,
η - viskozitu roztoku elektrolytu,
r - Stokesův poloměr rozpuštěné látky,
V - vložené napětí,
L - celkovou délku kapiláry.

Vlivem elektrického pole vzniká uvnitř kapiláry naplněné tlumivým r oztokem proud rozpouštědla nazývaný elektroosmotický tok. Rychlost elektroosmotického toku je dána elektroosmotickou pohyblivostí (Neo), která závisí na hustotě náboje na vnitřtmí stěně kapiláry a vlastnostech tlumivého r oztoku. Elektroosmotická rychlost (veo) je dána rovnicí:

veo = μeoE =		εζ		V
		η		L

v níž značí:
ε - permitivitu tlumivého r oztoku,
ζ - elektrokinetický (zeta) potenciál povrchu kapiláry.

Elektroforetická a elektroosmotická pohyblivost stanovované látky mohou mít stejný nebo opačný směr v závislosti na náboji (kladném nebo záporném) r ozpuštěné látky, takže rychlost rozpuštěné látky (v)je dána výrazem:

v = v_ep ± v_eo .

Součet nebo rozdíl dvou členů se použije podle toho, zda pohyblivosti mají stejný nebo opačný směr. Při velké elektroosmotické rychlosti vzhledem k elektroforetické rychlosti rozpuštěných látek mohou být záporně i kladně nabité stanovované látky separovány současně.

Čas (t), který rozpuštěná látka potřebuje k migraci po vzdálenosti (l), tj. od místa nástřiku do detekční cely (efektivní délka kapiláry), je dán výrazem:

t =	l	=	l.L
	vep ±  veo		( μep ±  μeo ). V

Většina křemenných kapilár používaných v elektroforéze má na svém vnitřním povrchu záporné náboje, které vyvolávají elektroosmotický tok směrem ke katodě. Pro získání dobré reprodukovatelnosti migrační rychlosti rozpuštěné látky musí zůstat elektroosmotický tok konstantní od analýzy k analýze. Pro některé aplikace je nutné snížit nebo potlačit elektroosmotický tok modifikací vnitřní stěny kapiláry nebo změnou pH tlumivého roztoku.

Po nástřiku vzorku do kapiláry migruje každý analyzovaný druh iontů vzorku nosným elektrolytem jako nezávislá zóna podle své elektroforetické pohyblivosti. Rozptyl zóny, což je rozšíření pásu každé rozpuštěné látky, je výsledkem několika různých jevů. V ideálním případě je jediným příspěvkem k r ozšíření zóny rozpuštěné látky molekulární difuze rozpuštěné látky podél kapiláry (podélná difuze). V tomto ideálním případě je účinnost separace, vyjádřená jako počet teoretických pater (N), dána výrazem:

N =	( μep ±  μeo ). V. l
	2. D. l

v němž značí:
D - difuzní koeficient rozpuštěné látky v tlumivém r oztoku.

V praxi mohou k rozšíření zóny významně přispívat i jiné jevy, jako je uvolňované teplo, adsorpce vzorku na stěnu kapiláry, rozdíly elektrické vodivosti vzorku a tlumivého roztoku (elektrodisperze), délka dávkované zóny, velikost (délka) detekční cely a nestejná úroveň hladin elektrolytu v elektrodových nádobkách.

Separace dvou zón (vyjádřené jako rozlišení R_S) může být dosaženo modifikací elektroforetické pohyblivosti stanovované látky, elektroosmotické pohyblivosti vyvolané v kapiláře a zvýšením účinnosti pro zónu každé stanovované látky podle rovnice:

RS =	√ N ( μepb -  μepa )
	4 ( μ‾ep ±  μeo )

v níž značí:
μ_epa a μ_epb - elektroforetickou pohyblivost dvou separovaných stanovovaných látek,
μ‾_ep - střední elektroforetickou pohyblivost dvou stanovovaných látek

[ μ‾ep =	1	( μepb + μepa )]
	2

Zařízení

Zařízení pro kapilární elektroforézu se skládá:

• z řiditelného zdroje stejnosměrného vysokého napětí,
• ze dvou nádobek na tlumivý roztok udržovaných na stejné úrovni, obsahujících předepsaný anodický a katodický roztok,
• ze dvou elektrod (anoda a katoda) ponořených do nádobek s tlumivým roztokem a připojených ke zdroji vysokého napětí,
• ze separační kapiláry (obvykle křemenné), která, je-li používána s určitými druhy detektorů, má v místě detekce opticky průhledné okénko; konce kapiláry jsou umístěny v nádobkách s tlumivým roztokem; kapilára je naplněna roztokem předepsaným v lékopisném článku,
• ze vhodného dávkovacího systému,
• z detektoru schopného sledovat množství zkoumané látky procházející úsekem kapiláry v daném čase; je obvykle založen na absorpční spektrofotometrii (ultrafialové a viditelné) nebo fluorimetrii, ale pro určité aplikace může být vhodná vodivostní, amperometrická nebo hmotnostně spektrometrická detekce; alternativní metodou používanou k detekci látek neabsorbujících UV záření a nefluoreskujících je nepřímá detekce,
• z termostatového systému schopného udržovat konstantní teplotu uvnitř kapiláry (doporučuje se pro získání dobré reprodukovatelnosti separace),
• zapisovače a vhodného integrátoru nebo počítače.

Pro přesnou kvantitativní analýzu je kritické určení způsobu dávkování a jeho automatizace. Dávkování může být hydrodynamické (hydrostatické, tlakové nebo vakuové) a elektrokinetické. Množství každé složky vzorku dávkovaného elektrokineticky závisí na její elektroforetické pohyblivosti, takže používání tohoto způsobu nástřiku vede k různému zastoupení nabitých složek v kapiláře.

Použijí se kapilára, tlumivé roztoky, metoda předúpravy kapiláry, roztok vzorku a migrační podmínky předepsané v článku uvažované látky. Použitý roztok elektrolytu se zfiltruje, aby se odstranily částice, a odplyní, aby se zabránilo tvorbě bublin, které způsobují rušení při detekci nebo přerušení elektrického proudu v kapiláře během separace. Pro každou analytickou metodu musí být vyvinut důkladný promývací postup, aby se dosáhlo reprodukovatelných migračních časů rozpuštěných látek.

Kapilární elektroforéza ve volném roztoku

Princip

Při kapilární elektroforéze ve volném roztoku jsou stanovované látky separovány v kapiláře obsahující pouze tlumivý roztok bez přísad zabraňujících proudění. Při této metodě dochází k separaci na základě různé r ychlosti migrace jednotlivých složek migrujících v oddělených zónách. Rychlost každé zóny závisí na elektroforetické pohyblivosti rozpuštěné látky a elektroosmotickém toku v kapiláře (viz Obecné principy). Pro zvýšení účinnosti separace látek, které jsou adsorbovány na křemenný povrch, mohou být použity kapiláry s vnitřním povlakem.

Tato varianta kapilární elektroforézy může být použita pro analýzu jak malých (M_r < 2000), tak i velkých molekul (2000 < M_r < 100 000). Díky vysoké účinnosti, které je v kapilární elektroforéze ve volném roztoku dosahováno, může být prováděna separace molekul, jež mají jen nepatrný rozdíl v poměru náboje ke hmotnosti. tento způsob separace umožňuje také separaci chirálních látek přidáním chirálního selektoru do separačního tlumivého roztoku.

Optimalizace

Optimalizace separace je komplexní proces, v němž mohou hrát významnou roli různé separační parametry. Hlavní faktory, které je třeba brát v úvahu při vývoji separace, jsou instrumentální parametry a parametry roztoku elektrolytu.
- Instrumentální parametry
Napětí. Čas separace je nepřímo úměrný vloženému napětí. Zvýšení napětí však může způsobit nadměrnou tvorbu tepla, které zvyšuje teplotu, výsledkem je gradient viskozity tlumivého roztoku v kapiláře. Tento jev způsobuje rozšíření zóny a snižuje r ozlišení.
Teplota. Teplota ovlivňuje především viskozitu a elektrickou vodivost tlumivého roztoku, a tím i migrační rychlost. V některy"ch případech může zvýšení teploty způsobit konformační změny bílkovin, což pozmění jejich migrační čas a účinnost separace.
Kapilára. Rozměry kapiláry (délka a vnitřní průměr) ovlivňují čas analýzy, účinnost separace a kapacitu. zvýšení celkové délky snižuje intenzitu elektrického pole (při konstantním napětí), což prodlouží migrační čas. Pro daný tlumivý roztok a intenzitu elektrického pole závisí uvolněné teplo a tím i rozšíření zóny vzorku na vnitřním průměru kapiláry. Ten také ovlivňuje detekční limit, který dále závisí na nastříknutém objemu vzorku a použitém detekčním systému.

Jelikož adsorpce složek vzorku na stěnu kapiláry omezuje účinnost, musí být při vývoji separační metody brány v úvahu postupy, které těmto interakcím zabraňují. V případě bílkovin bylo navrženo několik metod, jak zabránit adsorpci na stěnu kapiláry. Některé z těchto metod vyžadují pouze modifikaci složení tlumivého roztoku (použití extrémní hodnoty pH, adsorpce kladně nabitých přísad tlumivého roztoku). V jiných případech je vnitřní stěna kapiláry pokryta polymerem kovalentně vázaným na oxid křemičitý, který zabraňuje interakcím mezi bílkovinami a záporně nabitým křemenným povrchem. Pro Tyto účely jsou dostupné komerční kapiláry pokryté neutrálními hydrofilními, kationtovými a aniontovými polymery.
- Parametry roztoku elektrolytu
Složeni tlumivého roztoku a koncentrace. Vhodné tlumivé roztoky pro kapilární elektroforézu mají přiměřenou tlumivou kapacitu ve vybrané oblasti pH a nízkou elektrickou vodivost, aby se minimalizoval procházející elektrický proud.

Pro minimalizaci deformace zóny je důležité přizpůsobit pohyblivost koiontu tlumivého roztoku pohyblivosti rozpuštěné látky, pokud je to možné. Pro zaostření zóny vzorku v kapiláře, které zvyšuje separační účinnost a zlepšuje detekci, je také důležitý typ použitého rozpouštědla vzorku.

Zvýšení koncentrace tlumivého roztoku (pro dané pH) snižuje elektroosmotický tok a rychlost rozpuštěné látky.
pH tlumivého r oztoku. pH tlumivého roztoku může ovlivnit separaci změnou náboje stanovované látky nebo přísady a změnou elektroosmotického toku. Při separaci bílkovin a peptidů se při změně pH z hodnoty nad izoelektrickým bodem (pI) na hodnotu pod izoelektrickým bodem změní výsledný náboj rozpuštěné látky ze záporného na kladný. Zvýšení pH tlumivého roztoku obecně zvyšuje elektroosmotický tok.
Organická rozpouštědla. Organické modifikátory (methanol, acetonitril atd.) mohou být přidány do vodného tlumivého roztoku pro zvýšení rozpustnosti zkoušené látky nebo jiných přísad a/nebo pro ovlivnění stupně ionizace složek vzorku. Přídavek organických modifikátorů do tlumivého r oztoku obecně způsobuje snížení elektroosmotického toku.
Přísady pro chirální separace. Pro separaci optických izomerů se do separačního tlumivého roztoku přidává chirální selektor. Nejběžněji používané chirální selektory jsou cyklodextriny, ale mohou se také používat cyklické polyethery, polysacharidy a bílkoviny. Jelikož chirální rozlišení je řízeno rozdílnou interakcí chirálního selektoru s každým z enantiomerů, závisí dosažené rozlišení chirálníhh látek do značné míry na typu použitého chirálního selektoru. V tomto ohledu může být pro vývoj dané separace užitečné zkoušet cyklodextriny s různou velikostí dutiny (α-, β-, nebo γ-cyklodextrin) nebo modifikované cyklodextriny s neutrálními (methyl-, ethyl-, hydroxyalkyl- atd.) nebo ionizovatelnými (aminomethyl-, karboxymethyl-, sulfobutylether- atd.) skupinami. Při použití modifikovaných cyklodextrinů musí být brány v úvahu odchylky mezi jednotlivými šaržemi ve stupni substituce cyklodextrinů, které mohou ovlivňovat selektivitu. další faktory, které řídí rozlišení při chirálníhh separacích, jsou koncentrace chirálního selektoru, složení a pH tlumivého roztoku a teplota. Dosažené r ozlišení může být také pozměněno použitím organických přísad, jako je methanol nebo močovina.

Kapilární gelová elektroforéza

Princip

V kapilární gelové elektroforéze se separace provádí v kapiláře naplněné gelem, který působí jako molekulové síto. V tomto uspořádání se při daném poměru náboje k hmotnosti pohybují menší složky kapilárou rychleji než větší. Kapilární gelová elektroforéza se může použít pro separaci biologických makromolekul (bílkovin a fragmentů DNK) podle jejich molekulové hmotnosti.

Vlastnosti gelu

V kapilární elektroforéze se používají dva typy gelů: chemické a fyzikální. Chemické gely, jako je zesíténý polyakrylamid, jsou připravovány v kapiláře polymerací monomerů. Jsou obvykle navázány na křemennou stěnu a nemohou být odstraněny, aniž by nebyla zničena kapilára. Pokud se gely používají k separaci bílkovin, obsahuje separační tlumivý roztok obvykle dodecylsíran sodný a vzorky jsou před nástřikem denaturovány zahříváním ve směsi dodecylsíranu sodného

a 2-merkaptoethanolu nebo dithiothreitolu. Separace v zesítěných gelech může být optimalizována modifikací separačního tlumivého roztoku (jak je naznačeno v oddíle o kapilární elektroforéze ve volném roztoku) a regulací porozity gelu při jeho přípravě. Porozita zesítěných polyakrylamidových gelů může být ovlivněna změnou koncentrace akrylamidu a/nebo zastoupení sífovadla. Je pravidlem, že snížení porozity gelu vede ke snížení pohyblivosti rozpuštěných látek. Vzhledem k tuhostí těchto gelů se může používat pouze elektrokinetický nástřik.

Fyzikální gely jsou hydrofilní polymery, jako lineární polyakrylamid, deriváty celulosy, dextran atd., které mohou být rozpuštěny ve vodných separačních tlumivých roztocích za vzniku separačního média, které r ovněž působí jako molekulové síto. Tato separační média se připravují snáze než zesítěné polymery. Mohou být připraveny v zásobní nádobce a tlakem naplněny do kapiláry s pokrytou vnitřní stěnou (bez elektroosmotického toku). Výměna gelu před každým nástřikem obecně zlepšuje reprodukovatelnost separace. Porozita gelů se může zvýšit použitím polymerů o vyšší molekulové hmotnosti (při dané koncentraci polymeru) nebo snížením koncentrace polymeru (při dané molekulové hmotnosti polymeru). Snížení porozity gelu vede ve stejném tlumivém roztoku ke snížení pohyblivosti rozpuštěné látky. Rozpuštěním těchto polymerů v tlumivém r oztoku vznikají roztoky s nízkou viskozitou, proto se může použít jak hydrodynamický, tak elektrokinetický nástřik.

Kapilární izoelektrické fokusace

Princip

Při izoelektrické fokusaci se vlivem elektrického pole pohybují amfoterní molekuly, pokud jsou nabité, tj. pokud se nacházejí mimo oblast svého izoelektrického bodu, v gradientu pH tvořeném amfolyty s širokým rozsahem pI (polyaminokarboxylové kyseliny) rozpuštěnými v separačním tlumivém roztoku.

Třemi základními kroky izoelektrické fokusace jsou plnění, fokusace a mobilizace.
Plnění. Mohou být použity dva postupy:

• jednostupňové plnění; vzorek se smíchá s amfolyty a zavede se do kapiláry tlakem nebo vakuem.
• postupné plnění; do kapiláry se postupně zavede vedoucí roztok, amfolyty, vzorek smíchaný s amfolyty, opět samotné amfolyty a nakonec koncový roztok; objem vzorku musí být dostatečně malý, aby neovlivňoval gradient pH.

• v prvním postupu je mobilizace dosaženo během fokusace vlivem elektroosmotického toku; elektroosmotický tok musí být dostatečně malý, aby bylo dosaženo fokusace (dříve, než zóny projdou detektorem);
• v druhém postupu je mobilizace dosaženo působením pozitivního tlaku po fokusaci;
• ve třetím postupu je mobilizace dosaženo po fokusačním kroku přidáním solí do katodové nebo anodové nádobky (v závislosti na vybraném směru mobilizace), aby se změnilo pH v kapiláře, po vloženém napětí. Protože se změní

pH, jsou bílkoviny a amfolyty mobilizovány ve směru elektrodové nádobky, která obsahuje přidané soli a procházejí detektorem. dosažená separace vyjádřená jako ΔpI, závisí na gradientu pH dpH/ dx, počtu amfolytů s rozdílnou hodnotou pI, di

fuzním koeficientu stanovované látky (D), intenzitě elektrického pole (E) a změně elektroforetické pohyblivosti stanovované látky v závislosti na pH ( -dμ/ dpH ):

ΔpI = 3. √	D ( dpH / dx )
	E ( -dμ / dpH )

Optimalizace

Hlavní parametry, které je třeba brát v úvahu při vývoji separace, jsou:
Napětí. Při kapilární izoelektrické fokusaci se používá velmi vysoká intenzita elektrického pole, 300 V/cm až 1000 V/cm při fokusaci.
Kapilára. Podle zvolené metody mobilizace musí být snížen nebo potlačen elektroosmotický tok. Ke snížení elektroosmotického toku slouží kapiláry s pokrytou vnitřní stěnou.
Roztoky. Anodová nádobka je naplněna roztokem s pH nižším, než je pI nejkyselejšího amfolytu a katodová nádobka roztokem s pH vyšším, než je pI nejzásaditější~to amfolytu. Nejčastěji se používá kyselina fosforečná pro anodu a hydroxid sodný pro katodu.

Přidání polymeru, jako je např. methylcelulosa, vede k potlačení proudění a elektroosmotického toku zvýšením viskozity. Jsou dostupné komerční amfolyty v mnoha rozsazích pH, které mohou být smíchány k získání rozšířené oblasti pH. Široké rozsahy pH jsou používány k odhadu izoelektrického bodu, zatímco užší rozsahy ke zvýšení správnosti. Kalibrace se provádí přiřazením migračního času izoelektrickému bodu pro sérii standardních bílkovin (se známými hodnotami izoelektrického bodu).

Pokud je to nutné, zabraňuje se srážení bílkovin během fokusace přidáním přísad, jako např. glycerolu, tenzidů, močoviny nebo obojetných iontů (zwitteriontů), do tlumivého roztoku. V závislosti na koncentraci však močovina denaturuje bílkoviny.

Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC)

Princip

Při micelární elektrokinetické chromatografii se separace provádí v elektrolytovém roztoku, který obsahuje tenzid v koncentraci vyšší než kritická micelární koncentrace (cmc). Molekuly rozpuštěné látky jsou rozděleny mezi vodným tlumivým roztokem a pseudostacionární fází tvořenou micelami podle jeho rozdělovacího koeficientu. Tato metoda tedy může být považována za kombinaci elektroforézy a chromatografie. Je to metoda, která může být použita pro separaci jak neutrálních, tak nabitých látek při zachování účinnosti, r ychlosti a instrumentální vhodnosti kapilární elektroforézy. Jedním z nejšířeji používaných tenzídů v MEKC je aniontový tenzid dodecylsíran sodný, ačkoli se také používají jiné, např. kationtové tenzidy, jako jsou soli cetyltrimethylamonné.

Separační mechanismus je následující. Při neutrálním a alkalickém pH se tvoří silný elektroosmotický tok, který unáší ionty i neutrální molekuly separačního tlumivého roztoku směrem ke katodě. Pokud je jako tenzid použit dodecylsíran sodný, má elektroforetická migrace aniontových micel opačný směr, tj. k anodě. Výsledkem je, že celková rychlost migrace micel je zpomalena ve srovnání s objemovým tokem elektrolytu. V případě neutrálních rozpuštěných látek, kdy se stanovovaná látka může rozdělit mezi micely a vodný tlumivý roztok a nemá elektroforetickou pohyblivost, bude migrační rychlost stanovované látky záviset pouze na rozdělovacím koeficientu mezi micelou a vodným tlumivým r oztokem. Na elektroforeogramufsou píky nenabitých látek vždy mezi indikátorem elektroosmotického toku a indikátorem micel (čas ohraničený těmito dvěma píky se nazývá separační okno). Migrační rychlost elektricky nabitých látek závisí jak na rozdělovacím koeficientu mezi micelami a vodným tlumivým roztokem, tak na elektroforetické pohyblivosti v roztoku neobsahujícím micely.

Jelikož separační mechanismus neutrálních a slabě ionizovaných látek jev MEKC v podstatě chromatografický, migrace látky a rozlišení mohou být vysvětleny termínem kapacitní faktor látky (k'), známý též jako kapacitní poměr (D_m), který je poměrem látkového množství r ozpuštěných látek v micelách a látkového množství rozpuštěných látek v mobilní fázi. Pro neutrální látku je k' dán vztahem:

k' =	tr - t0					= K	VS
	t0		1 -	tr			Vm
				tm

v němž značí:
t_r - migrační čas rozpuštěné látky,
t₀ - čas analýzy nezadržované složky (určí se nástřikem indikátoru elektroosmotického toku, který nevstupuje do micel, např. methanolu),
t_m - migrační čas micel (určí se nástřikem micelového indikátoru, jako je Sudan III, který migruje nepřetržitě absorbován micelami),
K - rozdělovací koeficient rozpuštěné látky,
V_S - objem micelární fáze,
V_m - objem mobilní fáze. Podobně je dáno rozlišení dvou těsně migrujících látek (R_S):

RS =		.		.		.	1 -		t0
	√N		a - 1		kb'				tm
	4		a		kb' + 1		1 +		t0		k'
									tm

N - počet teoretických pater pro jednu z látek,  
α - selektivita,
k´_a, k´_b - kapacitní faktory látek a, b.

Podobně, ale ne identicky, jsou dány rovnice pro k' a R_S elektricky nabitých látek.

Optimalizace

Hlavní parametry, které je třeba brát v úvahu při vývoji separace pomocí MEKC, jsou parametry instrumentální a parametry roztoku elektrolytu.
- Instrumentální parametry
Napětí. Čas separace je nepřímo úměrný vloženému napětí. Zvýšení napětí však může způsobit nadměrnou tvorbu tepla, které tvoří gradient teploty a viskozity v průřezu kapiláry. Tento jev může být významný při použití vysoce vodivých tlumivých r oztoků, jakými jsou roztoky obsahující micely. Nedostatečný odvod tepla způsobuje rozšíření zón a snižuje rozlišení.
Teplota. Změny teploty v kapiláře ovlivňují rozdělovací koeficient látky mezi tlumivým roztokem a micelami, kritickou micelární koncentraci a viskozitu tlumivého roztoku. Tyto parametry přispívají k migračnímu času rozpuštěných látek. Použití dobrého chladicího systému zlepšuje reprodukovatelnost migračních časů rozpuštěných látek.
Kapilára. Stejně jako v kapilární elektroforéze ve volném r oztoku ovlivňují rozměry kapiláry (délka a vnitřní průměr) čas analýzy a účinnost separace. Prodloužení kapiláry snižuje intenzitu elektrického pole (při konstantním napětí), zvyšuje migrační čas a zvyšuje účinnost separace. Vnitřní průměr ovlivňuje odvod tepla (pro daný tlumivý roztok a intenzitu elektrického pole) a následně rozšíření zóny vzorku.
- Parametry roztoku elektrolytu
Typ tenzidu a koncentrace. Typ tenzidu ovlivňuje, stejně jako stacionární fáze v chromatografii, rozlišení, neboť spoluurčuje selektivitu separace. Hodnota log k' neutrální látky vzrůstá lineárně s koncentrací tenzidu v mobilní fázi. Protože

rozlišení při MEKC dosahuje maxima, když se k' přiblíží k hodnotě √ t_m/ t₀ , změna koncentrace tenzidu v mobilní fází

ovlivňuje dosažené rozlišení.
pH tlumivého roztoku. Ačkoli pH neovlivňuje rozdělovací koeficient neionizovaných látek, může ovlivnit elektroosmotický tok v nepokryté kapiláře. Snížení pH tlumivého roztoku snižuje elektroosmotický tok, a tím zvyšuje rozlišení neutrálních látek při MEKC. výsledkem je delší čas analýzy.

Organická rozpouštědla. Pro zlepšení MEKC separace hydrofobních látek mohou být do roztoku elektrolytu přidána organická rozpouštědla (methanol, propanol, acetonitril atd.). Přídavek těchto rozpouštědel obvykle snižuje migrační čas a selektivity separace. Přídavek organických rozpouštědel ovlivňuje kritickou micelární koncentraci. Proto může být daná koncentrace tenzidu použita pouze s určitou maximální koncentrací organického rozpouštědla, nad níž dochází k rozpadu micel. Rozpad micel v přítomnosti vysokého obsahu organického r ozpouštědla neznamená vždy, že separace není dále možná, v některých případech tvoří hydrofobní interakce mezi monomerem iontového tenzidu a neutrálními látkami solvofobní komplexy, které mohou být separovány elektroforeticky.
Přísady pro chirální separaci. Pro separaci chirálních látek použitím MEKC jev micelárním systému obsažen chirální selektor bud' kovalentně vázaný na tenzid, nebo přidaný do micelárního separačního média. mezi micely tvořené molekulami, které obsahují skupiny s vlastnostmi chirálntho selektoru, patří soli N-dodekanoyl-L-aminokyselin, soli žlučových kyselin atd. chirálního rozlišení může být také dosaženo přidáním chirálního selektoru, jako jsou cyklodextriny, do elektrolytového roztoku, který obsahuje micelizovaný achirální tenzid.
Další přísady. Modifikace selektivity přidáním činidel do tlumivého roztoku může být prováděna různými způsoby. Přidání různých typů cyklodextrinů do tlumivého roztoku může být také použito k potlačení interakcí hydrofobních látek s micelami a tím ke zvýšení selektivity pro tento typ látek.

Ke zlepšení selektivity separace se při MEKC používá přídavku látek, které mohou ovlivnit interakci rozpuštěné látky s micelou adsorpcí na micely. Touto přísadou může být druhý tenzid (ionogenní nebo neionogenní), ktery" způsobuje vznik směsných micel, nebo kationty kovů, které se rozpouštějí v micelách a tvoří koordinační komplexy s rozpuštěnýmilátkami.

Kvantitativní analýza

Plochy píků musí být vyděleny odpovídajícími migračními časy za vzniku korigovaných ploch, aby se kompenzoval:

• posun migračních časů od analýzy k analýze, a tím zmenšil rozptyl odezvy,
• rozdíl v odezvách složek vzorku s různými migračními časy.

Pokud se použije vnitřní standard, ověří se, že žádný pík zkoumané látky není překryt pikem vnitřního standardu.

Výpočty

Ze získaných hodnot se vypočte obsah stanovované složky nebo složek. Je-li předepsán procentuální obsah jedné nebo více složek zkoušené látky, vypočte se stanovením korigované plochy píku nebo píků jako procenta celkové korigované plochy všech piků, vyjma píků rozpouštědla nebo jakéhokoliv přidaného činidla (metoda normalizace). Doporučuje se použití automatického integračního systému (integrátoru nebo systému pro sběr a zpracování dat).

Způsobilost systému

Pro kontrolu chování systému kapilární elektroforézy se používají parametry způsobilosti systému. Výběr těchto parametrů závisí na použitém módu kapilární elektroforézy. Jsou to: kapacitní faktor (k´) (pouze pro micelární elektrokinetickou chromatografii), počet teoretických pater (N), faktor symetrie píku (A_S) a rozlišení (R_S). V předchozích částech byly popsány teoretické výrazy pro N a R_S, ale dále jsou uvedeny praktičtější r ovnice pro výpočet těchto parametrů z elektroforeogramů.

Počet teoretických pater

Počet teoretických pater (N) se vypočte pomocí výrazu:

N = 5.54		tr		2
		wh

v němž značí:
t_r - migrační čas nebo vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu sledovaného píku,
w_h - šířku píku v polovině jeho výšky.

Rozlišení

Rozlišení (R_s) mezi píky dvou složek s podobnými výškami se vypočte pomocí výrazu:

RS =	1.18 ( tR2 - tR1 )	kde tR2 > tR1
	wh1 + wh2

v němž značí:
t_R1 a t_R2 - migrační časy nebo vzdálenosti podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicemi spuštěnými z vrcholů dvou sousedních píků,
w_h1 a w_h2 - šířky píků v polovině jejich výšky.

Pokud je to vhodné, může být rozlišení vypočteno změřením výšky sedla (H_v) mezi dvěma částečně rozdělenými píky porovnávacího roztoku a výšky menšího píku (H_P) a vypočtením poměru pilou k sedlu:

p / v  =	Hp
	Hv

Faktor symetrie píku

Faktor symetrie píku (A_S) se vypočte ze vztahu:

AS  =	w0.05
	2d

v němž značí:
w_0,05 - šířka píku v jedné dvacetině jeho výšky,
d - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu ptlcu a vzestupnou častí píku v jedné dvacetině jeho výšky.

Jako parametry způsobilosti systému jsou uvedeny testy opakovatelnosti ploch (standardní odchylka ploch nebo poměrů ploch k migračním časům) a opakovatelnosti migračních časů (standardní odchylka migračních časů). opakovatelnost migračních časů slouží jako test způsobilosti promývacího procesu kapiláry. Alternativním postupem, jak zabránit snížení opakovatelnosti migračních časů je použití relativních migračních časů vzhledem k vnitřnímu standardu.

Pro stanovení příbuzných látek je vhodná zkouška ověření poměru signálu k šumu porovnávacího roztoku (nebo určení kvantitativního limitu).

Poměr signálu k šumu

Detekční limit odpovídá hodnotě poměru signálu k šumu rovné 3, kvantitativní limit hodnotě rovné 10.

Poměr signálu k šumu (S/N) se vypočte ze vztahu:

v němž značí:
H - výšku píku odpovídajícího dané složce na elektroforeogramu předepsaného porovnávacího roztoku, měřená mezi vrcholem píku a extrapolovanou základní linií signálu. Signál se sleduje v rozsahu rovném dvacetinásobku šířky píku v polovině jeho výšky,
h - rozsah šumu na elektroforeogramu získaného při slepé zkoušce a zaznamenaného na vzdálenosti r ovné dvacetinásobku šířky píku v polovině jeho výšky na elektroforeogramu předepsaného porovnávacího roztoku. Pokud je to možné, je tato vzdálenost situována rovnoměrně na obě strany od místa, kde by se tento pík nacházel.