2.4.18 Volný formaldehyd
Pokud není předepsáno jinak, použije se Metoda A. Metoda B je vhodná pro vakcíny, ke kterým byl přidán disiřičitan sodný k neutralizaci nadbytku formaldehydu.
Metoda A
1,0 ml humánní vakcíny se zředí předepsaným rozpouštědlem na 10,0 ml. 1,0 ml veterinárního bakteriálního toxoidu se zředí předepsaným rozpouštědlem na 25,0 ml (zkoušený roztok).
K 1 ml zkoušeného roztoku se přidají 4 ml vody R a 5 ml acetylacetonu RS1 a zkumavka s roztokem se ponechá 40 min ve vodní lázni při 40 °C.
Roztok není zbarven intenzívněji než porovnávací roztok připravený současně stejným způsobem za použití 1 ml zředěného formaldehydu RS obsahujícího 20µg formaldehydu (CH2O) v 1 ml místo zředěné vakcíny. Hodnotí se zkumavky ve směru jejich vertikální osy.
Metoda B
1,0 ml zkoušené vakcíny se zředí předepsaným rozpouštědlem na 100,0 ml. K 0,5 ml této zředěné vakcíny se přidá 5 ml roztoku methylbenzothiazolinonhydrazonhydrochloridu R (0,5 g/l) a 0,05 ml polysorbátu 80 R. Zkumavka se uzavře, protřepe a nechá stát 60 min. Po přidání 1 ml zkoumadla chlorid železitý-kyselina amidosírová R se nechá stát dalších 15 min. Potom se měří absorbance (2.2.25) zkoušeného roztoku při 628 nm proti kontrolnímu roztoku.
Absorbance zkoušeného roztoku není vyšší než absorbance porovnávacího roztoku připraveného současně a za stejných podmínek za použití 0,5 ml roztoku připraveného zředěním formaldehydu R obsahujícího 5 µg formaldehydu (CH20) v 1 ml.
Jestliže zkoušená vakcína je ve formě emulze, je nutno oddělit vodnou fázi následujícím způsobem:
K vakcíně se přidá stejný objemový díl isopropylmyristatu R a promíchá se. Ke 3 objemovým dílům této směsi se přidají 2 objemové díly kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS, 3 objemové díly chloroformu R a 4 objemové díly roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Směs se důkladně promíchá a odstřeďuje se 60 min při 15 000 gn. Oddělí se vodná vrstva a změří se její objem. Tato vrstva se použije k výše popsané zkoušce na formaldehyd.
Koncentrace formaldehydu v porovnávacím roztoku se upraví podle zředění vakcíny při oddělení vodné vrstvy. Jestliže se popsaným postupem vodná vrstva neoddělí, je nutné k roztoku chloridu sodného přidat roztok polysorbátu 20 R (100 g/l) a postup opakovat s tím rozdílem, že se odstřeďuje při 22 500 gn.