2.4.23 Steroly v mastných olejích

Separace sterolového podílu

Připraví se nezmýdelnitelný podíl, sterolový podíl mastného oleje se izoluje tenkovrstvou chromatografií (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R o tloušťce 0,3 mm až 0,5 mm.

Zkoušený roztok (a). Do baňky na 150 ml se zpětným chladičem se převede příslušný objem roztoku betulinu R (2 g/l) v dichlormethanu R (roztok vnitřního standardu). Obsah betulinu v tomto roztoku odpovídá asi 10 % obsahu sterolů ve zkoušeném vzorku (např. v případě olivového oleje se přidá 5OO µl, k ostatním rostlinným olejům se přidá 1500 µl roztoku betulinu R). Jestliže je v článku uveden požadavek na obsah jednotlivých sterolů vyjáďřený jako procento sterolového podílu, může být přídavek betulinu vynechán.

Roztok se odpaří v proudu dusíku R do sucha, přidá se 5,00 g zkoušené látky (m g), 50 ml hydroxidu draselného v lihu 2 mol/l RS a zahřívá se 1 h na vodní lázni pod zpětným chladičem za častého protřepávání. Po ochlazení na teplotu nižší než 25 °C se obsah baňky převede do dělicí nálevky pomocí 100 ml vody R. Protřepe se opatrně třikrát 100 ml etheru prostého peroxidických látek R. Spojené etherové výtřepky se v další dělicí nálevce mírně protřepávají několik min se 40 ml vody R. Vodná vrstva se odstraní a etherová vrstva se protřepává několikrát 40 ml vody R tak dlouho, dokud vodná vrstva již nereaguje zásadně na fenolftalein. Etherová vrstva se převede do předem zvážené baňky pomocí etheru prostého peroxidických látek R; dělicí nálevka se promyje etherem prostým peroxidických látek R a promývací tekutina se přidá k roztoku v baňce. Ether se opatrně oddestiluje, zbytek se smíchá s 6 ml acetonu R, rozpouštědlo se opatrně odpaří v proudu dusíku R a suší se při 100 °C až 105 °C do konstantní hmotnosti. Po ochlazení v exsikátoru se zváží. Zbytek se rozpustí v co nejmenším potřebném množství dichlormethanu R.

Zkoušený roztok (b). Použije se 5,00 g oleje řepkového R. Postupuje se způsobem uvedeným v odstavci Zkoušený roztok (a) počínaje slovy "přidá se 50 ml hydroxidu draselného v lihu 2 mol/l RS".

Zkoušený roztok (c). Použije se 5,00 g oleje slunečnicového R. Postupuje se způsobem uvedeným v odstavci Zkoušený roztok (a) počínaje slovy "přidá se 50 ml hydroxidu draselného v lihu 2 mol/l RS".

Porovnávací roztok. 25 mg cholesterolu R a 10 mg betulinu R se rozpustí v 1 ml dichlormethanu R.

Pro každý zkoušený roztok se použije samostatná vrstva. Na vrstvu se nanese odděleně do pruhu (20 mm x 3 mm) 20 µl porovnávacího roztoku a do pruhu (40 mm x 3 mm) po 0,4 ml zkoušeného roztoku (a), zkoušeného roztoku (b) nebo zkoušeného roztoku (c). Vyvíjí se směsí objemových dílů etheru R a hexanu R (35 + 65) po dráze 18 cm. Vrstvy se usuší v proudu dusíku R, postříkají se roztokem dichlorfluoresceinu R (2 g/l) v ethanolu R a pozorují se v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramu porovnávacího roztoku jsou skvrny ve tvaru pruhů odpovídající cholesterolu a betulinu. Na chromatogramech zkoušených roztoků jsou skvrny ve tvaru pruhů s podobnými hodnotami R_F, které odpovídají sterolům.

Z každého chromatogramu se vypreparuje plocha odpovídající ploše sterolových pruhů a kromě toho i plochy 2 mm až 3 mm nad a pod těmito pruhy odpovídajícími pruhům na chromatogramech porovnávacího roztoku. Do tří baněk na 50 ml se převedou odděleně vypreparované vrstvy a každá baňka se protřepe s 15 ml horkého dichlormethanu R. Každý roztok se zfiltruje filtrem ze sunutého skla (40) nebo vhodným filtračním papírem, každý filtr se promyje třikrát 15 ml dichlormethanu R. Filtráty a promývací tekutiny z každé filtrace se v předem zvážených baňkách odpaří v proudu dusíku R do sucha. Zbytek po odpaření se zváží.

Stanovení sterolů

Provede se plynová chromatografie (2.2.28). Zkouška se provádí za ochrany před vlhkostí. Roztoky se připravují těsně před použitím.

Zkoušený roztok. Ke sterolům získaným ze zkoušené látky separací tenkovrstvou chromatografií se přidá (na 1 mg zbytku po odpaření) 0,02 ml čerstvě připravené směsi objemových dílů chlortrimethylsilanu R, hexamethyldisilazanu R a pyridinu bezvodého R (1 + 3 + 9). Opatrně se protřepává do úplného rozpuštění sterolů a nechá se stát 30 min v exsikátoru nad oxidem fosforečným R. Je-li třeba, odstřeďuje se a použije se supernatantní tekutina.

Porovnávací roztok (a). K devíti dílům sterolů získaným z oleje řepkového R separací tenkovrstvou chromatografií se přidá jeden díl cholesterolu R. Ke směsi se přidá (na 1 mg zbytku po odpaření) 0,02 ml čerstvě připravené směsi objemových dílů chlortrimethylsilanu R, hexamethyldisilazanu R a pyridinu bezvodého R (1 + 3 + 9). Opatrně se protřepává do úplného rozpuštění sterolů. Nechá se stát 30 min v exsikátoru nad oxidem fosforečným R. Je-li třeba, odstředí se, použije se čirý roztok.

Porovnávací roztok (b). Ke sterolům získaným ze slunečnicového oleje R separací tenkovrstvou chromatografií se přidá (na 1 mg zbytku po odpaření) 0,02 ml čerstvě připravené směsi objemových dílů chlortrimethylsilanu R, hexamethyldisilazanu R a pyridinu bezvodého R (1 + 3 + 9). Opatrně se protřepává do úplného rozpuštění sterolů a nechá se stát 30 min v exsikátoru nad oxidem fosforečným R. Je-li třeba, odstřeďuje se a použije se supernatantní tekutina.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• kapilární křemenné kolony délky 20 m až 30 m a vnitřního průměru 0,32 mm s vnitřními stěnami pokrytými vrstvou poly[fenyl(5)methyl(95)]siloxanu R nebo poly[fenyl(5)methyl(94)vinyl(1)]siloxanu R (tloušťka vrstvy 0,25 µm),
• vodíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 30 cm/min až 50 cm/min nebo helia pro chromatografii R při průtokové rychlosti 20 cm/min až 35 cm/s. Měření průtokové rychlosti se provede takto: za podmínelk stanovení sterolů se nastříkne l µl až 3 µl methanu nebo propanu. Změří se čas v sekundách potřebný k průtoku plynu kolonou, tzn. od okamžiku nástřiku do okamžiku objevení píku (t_M). Průtoková rychlost je poměr l/t_M, v němž l značí délku kolony v centimetrech,
• plamenoionizačního detektoru,
• injektoru s děličem (1/50 nebo 1/100).

Teplota kolony se udržuje na 260 °C, teplota nástřikového prostoru na 280 °C, teplota detekktoru na 290 °C.

Nastříkne se odděleně po 1 µl každého roztoku. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) jsou čtyři hlavní píky odpovídající cholesterolu, brassikasterolu, kampesterolu a β-sitosterolu. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou čtyři hlavní píkky odpovídající kampesterolu, stigmasterolu, β-sitosterolu a Δ7-stigmastenolu. Retenční časy sterolů vztažené k retenčnímu času sitosterolu jsou uvedeny v tabulce 2.4.23-1.

Pík roztoku vnitřního standardu (betulin) musí být zřetelně oddělen od plků stanovovaných sterolů.

Tab. 2.4.23-1 Retenční časy sterolů vztažené k β-sitosterolu na dvou různých kolonách

Na chromatogramu zkoušeného roztoku se určí totožnost jednotlivých plkků a obsah jednotlivých sterolů ve sterolovém podílu zkoušené látky v procentech se vypočítá podle vztahu:

V němž značí:

A - plochu píku odpovídajícího stanovované složce,

S - součet ploch píků odpovídajících látkám uvedeným v tabulce 2.4.23-1.

Je-li to předepsáno v článku, vypočítá se obsah jednotlivých sterolů v miligramech na 100 g zkoušené látky podle vztahu:

V němž značí:

A - plochu píku stanovované složky,

A_S - plochu píku betulinu,

m - navážku zkoušené látky v gramech,

m_S - navážku přidaného betulinu v miligramech.