2.5.16 Bílkoviny v polysacharidových vakcínách

Podstata zkoušky. Bílkoviny se stanoví spektrofotometricky měřením intenzity zbarvení roztoků po reakci s vínanem mědnatým a zkoumadlem molybdenan-wolframovým.

Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu, aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi 5 mg/ml suchého polysacharidu. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah lahvičky (ampule) přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R. 1 ml tohoto roztoku se

přenese do skleněné zlcumavlcy, přidá se 0,15 ml roztoku kyseliny trichloroctové R (400 g/l). Roztok se protřepe, nechá se 15 min stát, 10 min se odstřed'uje při 5000 ot/min a supernatantní tekutina se odstraní. Ke zbytku ve zkumavce se přidá 0,4 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS. Porovnávací roztoky. 0,100 g albuminu hovězího R se rozpustí ve 100,0 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS (záldadní roztok obsahující 1 g/l bílkoviny).

1 ml základního roztoku se zředí hydroxidem sodným 0,1 mol/l RS na 20 ml (zředěný roztok (1): 50 mg bílkoviny v litru).

1 ml základního roztoku se zředí hydroxidem sodným 0,1 mol/l RS na 4 ml (zředěný roztok (2): 250 mg bílkoviny v litru).

Do šesti skleněných zkumavek se přenese 0,10 ml, 0,20 ml, 0,40 ml zředěného roztoku (1) a 0,15 ml, 0,20 ml, 0,25 ml zředěného roztoku (2). Obsah každé zkumavky se zředí hydroxidem sodným 0,1 mol/l RS na 0,4 ml.

Slepá zkouška. Použije se 0,40 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS (kontrolní roztok).

Postup. Do každé zkumavky se přidají 2 ml vínanu měánatého RS3, protřepe se a nechá se 10 min stát. Do každé zkumavky se dále přidá 0,2 ml směsi stejných objemových dílů zkoumadla fosfomolybdenan-wo framového R a vody R připravené těsně před použitím. Zkumavky se uzavřou, promíchají se převracením a směs se nechá stát 30 min ve tmě. Modré zbarvení je stálé 60 min. Je-li třeba, odstřed'uje se do získání čirých roztoků.

Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 760 nm proti kontrolnímu roztoku. Z absorbancí šesti porovnávacích roztoků a z jejich koncentrací bílkovin se sestrojí kalibrační křivka, ze které se odečte obsah bílkoviny ve zkoušeném roztoku.