2.5.19 O-acetyl v polysacharidových vakcínách

Podstata zkoušky. Spektrofotometrické stanovení O-acetylových skupin; měří se intenzita zbarvení vzniklého reakcí se železitou solí.

Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu, aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi 5 mg/ml suchého polysacharidu. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah lahvičky (ampule) přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R. Dále se roztok ředí tak, aby objemy použité ke zkoušce obsahovaly 30 /~g až 600µg aceýlcholiniumchloridu (O-acetyl). Ze zředěného roztoku se do šesti zkumavek přenese dvakrát po 0,3 ml, dvakrát po 0,5 ml a dvakrát po 1,0 ml (3 reakční roztoky a 3 lcorelcční roztoky).

Porovnávací roztoky. 0,150 g acetylcholiniumchloridu R se rozpustí v 10 ml vody R (základní roztok obsahující 15 g acetylcholiniumchloridu v litru).

Těsně před použitím se zředí 1 ml základního roztoku vodou R na 50 ml (zředěný roztok (1): 300 µg acetylcholiniumchloridu v 1 ml).

Těsně před použitím se zředí 1 ml základního roztoku vodou R na 25 ml (zředěný roztok (2): 600 µg acetylcholiniumchloridu v 1 ml).

Zředěný roztok (1) se přenese do čýř zkumavek; dvakrát po 0,1 ml a dvakrát po 0,4 ml (reakční roztoky a korekční roztoky).

Zředěný roztok (2) se přenese do čtyř dalších zkumavek; dvakrát po 0,6 ml a dvakrát po 1,0 ml (reakční a korekční roztoky).

Slepá zkouška. Použij e se 1 ml vody R ve zkumavce (kontrolní roztok).

Postup. Tekutiny ve všech zkumavkách se zředí vodou R na 1,0 ml. Do zkumavek s korekčními roztoky a do zkumavky s kontrolním roztokem se přidá 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 4 mol/l RS. Do všech zkumavek se pak přidají 2,0 ml hydroxylamoniumchloridu alkalického RS. Ponechá se reagovat přesně 2 min a pak se do zkumavek s reakčními roztoky přidá 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 4 mol/l RS. Dále se do všech zkumavek přidá 1,0 ml roztoku chloridu železitého R (100 g/l) v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS, zkumavky se uzavřou zátkou a třepáním se odstraní bubliny.

Měří se absorbance (2.2.25) všech roztoků při 540 nm proti kontrolnímu roztoku. Od hodnot absorbance reakčních roztoků se odečte absorbance příslušných korekčních roztoků. Z korigovaných hodnot absorbance čtyř porovnávacích roztoků se sestrojí kalibrační křivka (závislost korigované absorbance na obsahu acetylcholiniumchloridu) a na základě korigovaných hodnot absorbance zkoušených roztoků se odečte obsah acetylcholiniumchloridu ve zkoušených roztocích. Z odečtených tří hodnot se vypočítá průměr. 1 mol acetylcholiniumchloridu (181,7 g) odpovídá 1 molu O-acetylu (43,05 g).