2.5.20 Hexosaminy v polysacharidových vakcínách

Podstata zkoušky. Spektrofotometrické stanovení hexosaminů; měří se intenzita vzniklého zbarvení po hydrolýze polysacharidu, acetylaci hexosaminu a jeho reakci s dimethylaminobenzaldehydem.

Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu, aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi 5 mg/ml suchého polysacharidu. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah lahvičky (ampule) přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R Dále se roztok naředí tak, aby objemy použité ke zkoušce obsahovaly 125 /~g až 500 µg glukosaminu (hexosaminu). Ze zředěného roztoku se 1,0 ml přenese do kalibrované zlcumavlcy.

Porovnávací roztoky. 60 mg glukosamoniumchloridu R se rozpustí ve 100 ml vody R (základní roztok obsahující 0,500 g/l glukosaminu). Do čýř kalibrovaných zkumavek se přenese 0,25 ml, 0,50 ml, 0,75 ml a 1,0 ml základního roztoku.

Slepá zkouška. Použije se 1 ml vody R ve zkumavce (kontrolní roztok).

Roztoky ve všech zkumavkách se zředí vodou R na 1 ml. Do každé zkumavky se přidá 1 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové R (292 g/l). Zkumavky se uzavřou zátkou a zahřívají se 1 h ve vodní lázni. Po vychladnutí na pokojovou teplotu se do každé zkumavky přidá 0,05 ml roztoku thymolftaleinu R (5 gn) v lihu 96% R a dále se přidává roztok hydroxidu sodného R (200 g/l) až do vzniku modrého zabarvení. Potom se přidává do každé zkumavky kyselina chlorovodíková 1 mol/l RS, dokud se roztok neodbarví. Obsah každé zkumavky se zředí vodou R na 10 ml (neutralizované hydrolyzáty).

Do druhé řady kalibrovaných l Oml zkumavek se přenese 1 ml každého neutralizovaného hydrolyzátu. Přidá se 1 ml acetylacetonového zlcoumadla (čerstvě připravená směs obsahující 1 objemový díl acetylacetonu R a 50 objemových dílů roztoku uhličitanu sodného bezvodého R (53 g/l)) do každé zkumavky. Zkumavky se uzavřou zátkou a zahřívají 45 min ve vodní lázni při 90 °C a potom se ochladí na pokojovou teplotu. Do každé zkumavky se přidá 2,5 ml lihu 96% R a 1,0 ml roztoku dimethylaminobenzaldehydu (čerstvě připravený roztok: 0,8 g dimethylbenzaldehydu R se rozpustí v 15 ml lihu 96% R a přidá se 15 ml kyseliny chlorovodíkové R) a obsah každé zkumavky se zředí lihem 96% R na 10 ml. Zkumavky se uzavřou, obsah se promíchá obracením zkumavek a 90 min se ponechá ve tmě. Pak se změří absorbance (2.2.25) každého roztoku při 530 nm proti kontrolnímu roztoku. Sestrojí se kalibrační křivka vynesením absorbance čtyř porovnávacích roztoků proti obsahu hexosaminu, ze které se odečte množství hexosaminu ve zkoušeném roztoku.