2.5.21 Methylpentosy v polysacharidových vakcínách
Podstata zkoušky. Spektrofotometrické stanovení methylpentos; měří se intenzita zbarvení po hydrolýze polysacharidu a reakci s cysteiniumchloridem.
Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu, aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi 5 mg/ml suchého polysacharidu. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah lahvičky (ampule) přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R. Dále se roztok zředí tak, aby objemy použité ke zkoušce obsahovaly 2 µg až 20 µg rhamnosy (methylpentosy). 0,25 ml, 0,50 ml a 1,0 ml zředěného roztoku se převede do tří zkumavek.
Porovnávací roztoky. 0,100 g rhamnosy R se rozpustí ve 100 ml vody R (základní roztok obsahující 1 g/l methylpentosy). Těsně před použitím se 1 ml zákadního roztoku zředí vodou R na 50 ml (zře
Děný roztok obsahující 20 mg/l methylpentosy). Do pěti zkumavek se přenese 0,10 ml, 0,25 ml, 0,50 ml, 0,75 ml a 1,0 ml zředěného roztoku.
Slepá zkouška. Použij e se 1 ml vody R ve zkumavce (kontrolní roztok).
Postup. Obsah všech zkumavek se žredí vodou R na 1 ml. Zkumavky se vloží do lázně s ledovou vodou a postupně se za stálého míchání po kapkách přidává do každé zkumavky 4,5 ml zchlazené směsi obsahující 1 objemový díl vody R a 6 objemových dílů kyseliny sírové R. Zkumavky se pak zahřejí na pokojovou teplotu a na několik minut se vloží do vodní lázně a ochladí se na pokojovou teplotu. Do každé zkumavky se přidá 0,10 ml čerstvě připraveného roztoku cysteiniumchloridu R (30 g/l). Protřepe se a ponechá 2 h stát.
Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 396 nm a 430 nm proti kontrolnímu roztoku. Pro každý roztok se vypočítá rozdíl hodnot absorbancí měřených při 396 nm a 430 nm. Ze zjištěných rozdílů absorbancí pro pět porovnávacích roztoků se sestrojí kalibrační křivka (závislost rozdílu absorbancí na obsahu methylpentosy), ze které se odečte obsah methylpentosy v každém zkoušeném roztoku. Ze zjištěných hodnot se vypočítá průměr.