2.5.23   Kyselina sialová v polysacharidových vakcínách

Podstata zkoušky. Po ultrafiltraci přípravku se stanoví kyselina sialová spektrofotometriclcy měřením intenzity zbarvení roztoku po reakci se zkoumadlem resorcinolovým a vytřepání do organického rozpouštědla.

Zkoušený roztok. Obsah jedné nebo více lahviček (ampulí) zkoušeného přípravku se kvantitativně přenese do odměrné baňky vhodného objemu. zředí se na potřebný objem vodou R tak, aby vznikl roztok polysacharidu o známé koncentraci asi 250 μg/ml. Za použití injekční stříkačky se přenesou 4,0 ml tohoto roztoku do l Oml ultrafiltrační kyvety vhodné pro průchod molekul o relativní molekulové hmotnosti menší než 50 000. Stříkačka se dvakrát propláchne vodou R a promývací tekutina se přenese do ultrafiltrační kyveý. Ultrafiltrace se provádí za stálého míchání pod dusíkem a při tlaku asi 150 kPa. Pokaždé, když objem kapaliny v kyvetě ldesne na 1 ml, se kyveta znovu naplní vodou R a pokračuje se, dokud není zfiltrováno 200 ml a zbytek v lcyvetě je asi 2 ml. zbylá tekutina se z kyvety přenese stříkačkou do 10 ml oďměrné baňky. Kyveta se promyje třikrát 2 ml vody Pc, promývací tekutina se přidá do odměrné baňky a zředí se vodou R na 10,0 ml (zkoušený roztok). Do každé ze dvou zkumavek se přenesou 2,0 ml zkoušeného roztoku.

Porovnávací roztoky. Použijí se porovnávací roztoky předepsané v článku. Připraví se dvě řady po třech zkumavkách a do zkumavek každé řady se přenese 0,5 ml, 1,0 ml a 1,5 ml porovnávacího roztoku odpovídajícího typu zkoušené vakcíny. Obsah každé zlcumavlcy se zředí vodou R na 2,0 ml. Slepá zkouška. Do dvou zkumavek se přenese po 2,0 ml vody R (kontrolní roztoky).

Postup. Do všech zkumavek se přidá po 5,0 ml zkoumadla resorcinolového R, zkumavky se zahřívají 15 min při 105 °C, ochladí se studenou vodou a přemístí se do lázně s ledovou vodou. Do každé zkumavky se přidá 5 ml isoamylakoholu R, důklaďně se promíchá a zkumavky se ponechaj í 15 min v lázni s ledovou vodou. Zkumavky se odstřed'ují a ponechají se v lázni s ledovou vodou do spektrofotometriclcého měření. Měří se absorbance (2.2.25) každé supernatantní tekutiny při 580 nm a 450 nm proti isoamylalkoholu R. Pro každou vlnovou délku se vypočte absorbance jako průměr hodnot naměřených u dvou stejných roztoků a od těchto hodnot se odečte průměrná hodnota zjištěná u kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce. Sestrojí se graf ukazující rozdíl mezi absorbancí porovnávacího roztoku při 580 nm a 450 nm jako funkce obsahu kyseliny sialové (kyseliny N-acetylneuraminové) a z grafu se odečte množství kyseliny sialové ve zkoušeném roztoku.