Lékopis - Celkové bílkoviny

Český lékopis 1997

2.5.33 Celkové bílkoviny

2001

Mnohé metody stanovení obsahu popsané v této kapitole mohou být provedeny za použití komerčně dostupných souprav.

Metoda 1

Bílkovina v roztocích absorbuje ultrafialové světlo při vlnové délce 280 nm, což je způsobeno přítomností aromatických aminokyselin ve struktuře bílkoviny, hlavně tyrosinu a tryptofanu. Tato vlastnost může být využita pro stanovení obsahu. Jestliže tlumivý roztok použitý k rozpuštění bílkoviny má vyšší absorbanci než voda, obsahuje rušicí látky. Toto rušení může být odstraněno použitím tlumivého roztoku jako kontrolní kapaliny, ale přesto mohou být výsledky ovlivněny, pokud rušicí látky mají vysokou absorbanci. Při nízkých koncentracích bílkovina adsorbovaná na kyvetu může výrazně snížit obsah bílkoviny v roztoku, což může být předem vyloučeno přípravou vzorků o vyšší koncentraci nebo použitím neionogenních detergentů při přípravě.
Zkoušený r oztok. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v předepsaném tlumivém r oztoku tak, aby koncentrace bffkoviny v získaném roztoku byla v rozmezí 0,2 mg/ml až 2 mg/ml.
Porovnávací roztok. Připraví se roztok vhodné r eferenční látky pro stanovení bílkovin rozpuštěné ve stejném tlumivém roztoku a o stejné koncentraci bffkoviny jako zkoušený roztok.
Postup. zkoušený roztok, porovnávací roztok a kontrolní kapalina se během této zkoušky udržují při stejné teplotě. Měří se absorbance (2.2.25) zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku v křemenných kyvetách při 280 nm proti předepsanému tlumivému roztoku jako kontrolní kapalině. K získání správných výsledků musí být odezva lineární v rozmezí koncentrací bílkoviny.
Rozptyl světla. přesnost stanovení bílkoviny může být zmenšena rozptylem světla ve zkoušeném vzorku. Jestliže se bffkoviny v roztoku vyskytují jako částice srovnatelné velikostí s vlnovou délkou měřeného světla (250 nm až 300 nm), rozptyl světelných paprsků vyvolá vzrůst absorbance zkoušeného vzorku. Pro výpočet absorbance při 280 nm způsobené rozptylem světla se změří absorbance zkoušeného r oztoku při vlnových délkách 320 nm, 325 nm, 330 nm, 335 nm, 340 nm, 345 nm a 350 nm. Sestrojí se závislost logaritmu získaných absorbancí proti logaritmu vlnových délek a sestrojí se kalibrační křivka proložením nejvhodnějších bodů lineární regresí. Křivka se extrapoluje k získání logaritmu absorbance při 280 nm. Antilogaritmus této hodnoty je absorbance přisuzovaná rozptylu světla. K získání hodnoty absorbance bffkoviny v roztoku se získané hodnoty korigují odečtením absorbance přisuzované rozptylu světla od celkové absorbance při 280 nm. Ke snížení vlivu rozptylu světla může být použita filtrace přes filtr (0,2 µm), který neadsorbuje bílkoviny, nebo vyčeření odstředěním, zvláště, je-li roztok nápadně zakalený.
Výpočty. Pro výpočet se použijí korigované hodnoty. Koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku (C~) se vypočítá podle následujícího vztahu:

C_u = C_s(A_u/ A_s),

v němž značí:
C_s - koncentraci bílkoviny v porovnávacím roztoku,
A_u - korigovanou absorbanci zkoušeného roztoku,
A_s - korigovanou absorbanci porovnávacího roztoku.

Metoda 2

Tato metoda (obvykle uváděná jako Lowryho stanovení) je založena na r edukci fosfomolybdenan-wolframového směsného chromoforu bílkovinou ve zkoumadlu fosfomolybdenan-wolframovém, který vykazuje absorpční maximum při 750 nm. zkoumadlo fosfomolybdenan-wolframové nejdříve reaguje se zbytky tyrosinu v bílkovině. Intenzita zbarvení je nejvyšší po 20min až 30min stání při pokojové teplotě, po této době se intenzita zbarvení postupně ztrácí.

Protože tato metoda je citlivá na rušicí látky, může se použít postup srážení bílkoviny ze zkoušeného vzorku. Většina rušicích látek vyvolává odbarvování, avšak naopak některé detergenty vyvolávají slabý růst intenzity zbarvení. Vysoké koncentrace solí mohou vyvolávat tvorbu sraženiny. Referenční látka a zkoušená bílkovina musí být shodné, protože různé druhy bílkovin mohou způsobit různou intenzitu zbarvení. Tam, kde je nutné oddělení rušicích látek od bílkoviny ve zkoušeném vzorku, je třeba před přípravou vzorku provést oddělení r ušicích látek níže uvedeným postupem. Vliv rušicích látek může být minimalizován naředěním tak, aby koncentrace zkoušené bílkoviny zůstala dostatečná pro přesné měření.

K přípravě všech tlumivých roztoků a zkoumadel použitých v této metodě se použije voda destilovaná R.
Zkoušený roztok. vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku tak, aby koncentrace získaného roztoku byla v rozmezí kalibrační křivky. Vhodný tlumivý roztok udržuje pH roztoku na hodnotě 10,0 až 10,5.
Porovnávací r oztoky. Referenční látka pro stanovení bílkoviny se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku. Tento roztok se dále zředí stejným tlumivým roztokem tak, aby se získalo nejméně pět porovnávacích roztoků o koncentraci bílkoviny rovnoměrně r ozložené ve vhodném rozmezí mezi 5 μg/ml a 100 μg/ml.
Kontrolní r oztok. Použije se tlumivý roztok použitý k přípravě zkoušeného roztoku a porovnávacích roztoků.
Zkoumadlo se síranem měďnatým. 100 mg síranu měďnatého R a 0,2 g vínanu sodného R se rozpustí ve vodě destilované R a zředí se jí na 50 ml. 10 g uhličitanu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě destilované R a zředí se jí na 50 ml. Pomalu za míchání se lije roztok uhličitanu sodného do roztoku síranu měďnatého. Použije se během 24 h.
Alkalické zkoumadlo s mědí. Smíchají se objemové díly zkoumadla se síranem mědnatým, roztoku dodecylsíranu sodného R (50 g/l) a roztoku hydroxidu sodného R (32 g/l) (1 + 2 + 1). Uchovává se při pokojové teplotě a použije se během 2 týdnů.
Zkoumadlo fosfomolybdenan-wolframové zředěné. Smíchá se 5 ml zkoumadla fosfomolybdenan-wolframového R s 55 ml vody destilované r . Uchovává se v hnědé nádobě při pokojové teplotě.
Postup. K 1,0 ml každého porovnávacího roztoku, zkoušeného roztoku a kontrolního roztoku se přidá po 1,0 ml alkalického zkoumadla s mědí a promíchá se. Nechá se stát 10 min. Přidá se po 0,5 ml zkoumadla fosfomolybdenan-wolframového zředěného, promíchá se a nechá se stát 30 min při pokojové teplotě. Absorbance (2.2.25) roztoků se měří při 750 nm proti kontrolnímu r oztoku.
Výpočty. Závislost absorbance na koncentraci bílkoviny je nelineární; avšak, je-li rozmezí koncentrací použitých k přípravě kalibrační křivky dostatečně malé, blíží se přímce. Vynesou se absorbance porovnávacích r oztoků proti koncentracím bílkoviny a použitím lineární regrese se sestrojí kalibrační křivka, z níž se za použití naměřené absorbance odečte koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.
Rušicí látky. V následujícím postupu se před stanovením ke zkoušenému vzorku přidává kyselina deoxycholová-trichloroctová k odstranění rušicích látek vysrážením bílkovin; tento postup může být též použit k zahuštění bílkovin ze zředěných roztoků.

K 1 ml roztoku zkoušené látky se přidá 0,1 ml roztoku natriumdeoxycholatu R (1,5 g/l). Promíchá se vířivou míchačkou a nechá se stát 10 min při pokojové teplotě. Přidá se 0,1 ml roztoku kyseliny trichlorooctové R (720 g/l) a promíchá se vířivou míchačkou. Odstřed'uje se 30 min při 3000 g_n, kapalina se dekantuje a zbytek tekutiny se odstraní pipetou. Sbalená bílkovina se znovu rozpustí v 1 ml alkalického zkoumadla s mědí.

Metoda 3

Tato metoda (obvykle uváděná jako Bradfordovo stanovení) je založena na absorpčním posunu z 470 nm na 595 nm, který se získá, jestliže modř kyselá 90 se naváže na bílkovinu. Nejzřetelněji se modř kyselá 90 naváže na zbytky argininu a lysinu v bílkovině, což může vést ke změnám v odezvě obsahu r ůzných bílkovin. Bílkovina použitá jako referenční látka musí být proto shodná se stanovovanou bílkovinou. Existuje relativně málo rušicích látek, ale je dávána přednost nepoužití detergentů a amfolytů ve zkoušeném vzorku. Silně alkalické vzorky mohou interferovat s kyselými zkoumadly.

Nepoužívají se křemenné kyvety, protože se barvivo váže na tento materiál.

Výpočty. Závislost absorbance na koncentraci bílkoviny je nelineární; avšak, je-li rozmezí koncentrací použitých k přípravě kalibrační křivky dostatečně malé, blíží se přímce. Vynesou se absorbance porovnávacích r oztoků proti koncentracím bílkoviny a použitím lineární regrese se sestrojí kalibrační křivka, z níž za použití absorbance se odečte koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

Metoda 4

Tato metoda (obvykle uváděná jako stanovení obsahu kyselinou bicinchoninovou neboli BCA) je založena na redukci měd'nafch iontů (Cu²⁺) na měďné (Cu⁺) bílkovinou. Zkoumadlo BCA se používá k detekci měďných iontů. Reakci ruší některé látky. Vliv rušicích látek může být snížen zředěním tak, aby koncentrace zkoušené bílkoviny zůstala dostatečná pro přesné měření. Alternativně se může použít k odstranění rušicích látek postup srážení bílkoviny uvedený v metodě 2. Referenční látka a zkoušená bílkovina musí být stejné, protože různé druhy bílkovin reagují různou barevnou intenzitou.

K přípravě všech tlumivých roztoků a zkoumadel použitých v této metodě se použije voda destilovaná R.

Zkoušený roztok. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku tak, aby koncentrace roztoku byla v rozmezí koncentrací porovnávacích roztoků.
Porovnávací roztoky. Referenční látka pro stanovení bílkoviny se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku. Tento roztok se zředí stejným tlumivém roztokem tak, aby se získalo nejméně pět porovnávacích roztoků o koncentraci bukoviny rovnoměrně rozložené ve vhodném r ozmezí mezi 10 μg/ml a 1200 μg/ml.
Kontrolní roztok. Použije se tlumivý roztok použitý k přípravě zkoušeného roztoku a porovnávacích r oztoků.
BCA zkoumadlo. 10 g dinatriumbicinchoninatu R, 20 g uhličitanu sodného monohydrátu R, 1,6 g vínanu sodného R, 4 g hydroxidu sodného R a 9,5 g hydrogenuhličitanu sodného R se r ozpustí ve vodě destilované R. Je-li třeba, upraví se pH roztokem hydroxidu sodného R nebo roztokem hydrogenuhličitanu sodného R na hodnotu 11,25, zředí se vodou destilovanou R na 1000 ml a promíchá se.
BCA zkoumadlo s mědí. Smíchá se 1 ml roztoku síranu měďnatého R (40 g/l) s 50 ml BCA zkoumadlo.
Postup. 0,1 ml každého porovnávacího roztoku, zkoušeného roztoku a kontrolního roztoku se smíchá se 2 ml BCA zkoumadlo s mědí. Roztoky se udržují 30 min při 37 °C, zaznamená se čas a směs se ochladí na pokojovou teplotu. Do 60 min od konce inkubace se měří absorbance (2.2.25) porovnávacích roztoků a zkoušeného r oztoku v křemenných kyvetách při 562 nm proti kontrolnímu roztoku. Po ochlazení r oztoků na pokojovou teplotu se intenzita zbarvení pravidelně zvyšuje.

Výpočty. Závislost absorbance na koncentraci bílkoviny je nelineární; avšak, je-li rozmezí koncentrací použitých k přípravě kalibrační křivky dostatečně malé, blíží se přímce. Vynesou se absorbance porovnávacích r oztoků proti koncentracím bílkoviny a použitím lineární regrese se sestrojí kalibrační křivka, z níž se za použití naměřené absorbance odečte koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

Metoda 5

Tato metoda (obvykle uváděna jako biuretové stanovení obsahu) je založena na interakci mědnatých iontů (Cu²⁺) s bffkovinou v alkalickém roztoku; výsledná absorbance se měří při 545 nm. Tato zkouška vykazuje minimální rozdíly mezi ekvivalentem IgG a vzorky albuminu. Přidání hydroxidu sodného a zkoumadla biuretového jako složeného zkoumadla, nedostatečné promíchání po přídavku hydroxidu sodného a nebo nadbytečná doba mezi přídavkem hydroxidu sodného a přídavkem zkoumadla biuretového mohou způsobit u vzorků IgG vyšší odezvu než u vzorků albuminu. K minimalizaci vlivu rušicích látek na stanovení bílkovin se může použít metoda kyseliny trichlorooctové u zkoušených vzorků s obsahem bílkoviny nižším než 500 μg/ml.

K přípravě všech tlumivých roztoků a zkoumadel použitých v této metodě se použije voda destilovaná R.

Zkoušený roztok. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v r oztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace roztoku byla v r ozmezí koncentrací porovnávacích roztoků.
Porovnávací roztoky. r eferenční látka pro stanovení bílkoviny se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Tento roztok se zředí roztokem chloridu sodného r (9 g/l) tak, aby se získaly nejméně tři porovnávací roztoky o koncentraci bílkoviny rovnoměrně rozložené ve vhodném rozmezí mezi 0,5 mg/ml a 10 mg/ml.
Kontrolní roztok. Použije se roztok chloridu sodného r (9 g/l).
Zkoumadlo biuretové. 3,46 g síranu mědňatého r se rozpustí v 10 ml horké vody destilované R a nechá se ochladit (roztok A). 34,6 g citronanu sodného R a 20,0 g uhličitanu sodného bezvodého R se rozpustí v 80 ml horké vody destilované R a nechá se ochladit (roztok B). Roztoky A a B se smíchají a zředí se vodou destilovanou R na 200 ml. Použije se během 6 měsíců. Zkoumadlo nelze použít, jestliže se zakalí nebo obsahuje-li sraženinu.
Postup. K jednomu objemovému dílu zkoušeného roztoku se přidá stejný objemový díl roztoku hydroxidu sodného R (60 g/l) a promíchá se. Ihned se přidá zkoumadlo biuretové, odpovídající 0,4 objemovým dílům zkoušeného roztoku, a rychle se promíchá. Nechá se stát nejméně 15 min při 15 °C až 25 °C. Během 90 min po přidání biuretového zkoumadla se měří absorbance (2.2.25) porovnávacích roztoků a zkoušeného roztoku v maximu při 545 nm proti kontrolnímu roztoku. Pro výpočet obsahu bílkoviny se nepoužije žádný z roztoků, který měl zákal nebo sraženinu.
Výpočet. Závislost absorbance na koncentraci bílkoviny je téměř lineární v daném rozmezí koncentrací bílkoviny v porovnávacích roztocích. vynesou se absorbance porovnávacích roztoků proti koncentracím bílkoviny a použitím lineární regrese se sestrojí kalibrační křivka. Vypočítá se korelační koeficient kalibrační křivky. Vhodný systém je takový jehož přímka má korelační koeficient nejméně 0,99. Z kalibrační křivky se za použití naměřené absorbance odečte koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.
Rušicí látky. Aby se minimalizoval vliv rušicích látek, může se bílkovina ze zkoušené látky srážet takto: 0,1 objemového dílu roztoku kyseliny trichlorooctové R (500 g/l) se přidá k 1 objemovému dílu zkoušeného roztoku, supernatantní tekutina se odstraní, sraženina se rozpustí v malém množství hydroxidu sodného 0,5 mol/l r S. Tento roztok se použije k přípravě zkoušeného roztoku.

Metoda 6

Tato fluorimetrická metoda je založena na derivatizaci bílkoviny s o-ftalaldehydem, který reaguje s primárními aminy blkoviny (N-terminální aminokyseliny a E-aminoskupiny lysinových zbytků). Citlivost zkoušky může být zvýšena hydrolýzou bílkoviny provedenou před přídavkem o-ftalaldehydu. Hydrolýza umožňuje α-aminoskupinám obsaženým v aminokyselinách reagovat se zkoumadlem ftalaldehydovým. Tato metoda vyžaduje velmi malá množství bílkoviny. Je nutné se vyvarovat nebo vyloučit primární aminy, jako např. trometamol a tlumivé roztoky s aminokyselinami, protože r eagují se zkoumadlem ftalaldehydovým. Amoniak při vysoké koncentraci reaguje s ftalaldehydem. Reagují-li aminy s ftalaldehydem, je získaná fluorescence nestabilní. Použití automatizovaného postupu ke standardizaci tohoto postupu může zlepšit správnost a přesnost zkoušky.

K přípravě všech tlumivých roztoků a zkoumadel použitých v této metodě se použije voda destilovaná R.

Zkoušený roztok. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v r oztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace roztoku byla v r ozmezí koncentrací porovnávacích roztoků. Před přidáním zkoumadla ftalaldehydového se upraví pH na hodnotu 8 až 10,5.
Porovnávací roztoky. Referenční látka pro stanovení bílkoviny se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Tento roztok se zředí roztokem chloridu sodného r (9 g/l) tak, aby se získalo nejméně pět porovnávacích roztoků o koncentraci bílkoviny rovnoměrně rozložené ve vhodném rozmezí mezi 10 μg/ml a 200 μg/ml. Před přidáním zkoumadla ftalaldehydového se upraví pH na hodnotu 8 až 10,5.
Kontrolní roztok. Použije se roztok chloridu sodného r (9 g/l).
Tlumivý roztok boritanový. 61,83 g kyseliny borité R se rozpustí ve vodě destilované R, upraví se pH roztokem hydroxidu draselného R na hodnotu 10,4, zředí se vodou destilovanou r na 1000 ml a promíchá se.
Ftalaldehydový zásobní roztok. 1,20 g ftaldialdehydu R se rozpustí v 1,5 ml methanolu R, přidá se 100 ml tlumivého roztoku boritanového a promíchá se. Přidá se 0,6 ml roztoku lauromakrogolu 23 R (300 g/l) a promíchá se. Uchovává se při pokojové teplotě a použije se během tří týdnů.
Zkoumadlo ftalaldehydové. K 5 ml ftalaldehydového zásobního roztoku se přidá 15 µl 2-merkaptoethanolu r . Připraví se nejméně 30 min před použitím. Použije se během 24 h.
Postup. 10 μl zkoušeného roztoku a po 10 μl každého z porovnávacích roztoků se smíchá s 0,1 ml zkoumadla ftalaldehydového a nechá se stát 15 min při pokojové teplotě. Přidají se 3 ml hydroxidu sodného 0,5 mol/l RS a promíchá se. Měří se intenzity fluorescence (2.2.21) porovnávacích roztoků a zkoušeného roztoku při excitační vlnové délce 340 nm a emisní vlnové délce v rozmezí 440 nm až 455 nm. Fluorescence daného vzorku se měří jen jednou, neboť záření snižuje intenzitu fluorescence.
Výpočty. Závislost fluorescence na koncentraci bílkoviny je lineární. Vynesou se intenzity fluorescence porovnávacích roztoků proti koncentracím bílkoviny a použitím lineární regrese se sestrojí kalibrační křivka. Z kalibrační křivky a z intenzity fluorescence zkoušeného roztoku se stanoví koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

Metoda 7

Tato metoda je založena na dusíkové analýze jako prostředku stanovení bílkovin. Rušení způsobené přítomností dalších látek obsahujících dusík ve zkoušené látce může ovlivnit stanovení bílkoviny touto metodou. Metodou stanovení dusíku se vzorek během analýzy rozkládá, ale metoda není omezena na přítomnost bílkoviny ve vodných prostředích.
Postup A. Provede se postupem uvedeným ve zkoušce Dusík mineralizací s kyselinou sírovou (2.5.9), nebo se použije komerčně dostupné zařízení pro stanovení dusíku podle Kjeldahla.
Postup B. Komerčně dostupné zařízení lze použít pro dusíkovou analýzu. Nejpoužívanější instrumentální metodou je pyrolýza (tj. spalování vzorku v kyslíku při teplotách blížících se 1000 °C), při které z dusíku přítomného ve zkoušené látce vznikají oxid dusnatý (NO) a další oxidy dusíku (NO_x). Některá zařízení mění oxidy dusíku na dusík (plyn), který se stanovuje termálně vodivostním detektorem. Jiná zařízení míchají oxid dusnatý (NO) s ozonem (O₃) za vzniku excitovaného oxidu dusičitého (NO₂), který při rozpadu emituje světlo a může být stanoven chemiluminiscenčním detektorem. Referenční bílkovina, která je relativně čistá a složením se shoduje se zkoušenými bílkovinami, se používá k optimalizaci nástřiků a parametrů pyrolýzy a k dosažení konzistence při analýze.
Výpočty. Koncentrace bílkoviny se vypočítá dělením obsahu dusíku ve vzorku o známé koncentraci obsahu bílkoviny. Známý obsah dusíku bílkoviny může být stanoven z chemického složení bílkoviny nebo porovnáním s vhodnou referenční látkou.