2.6.1 Zkouška na sterilitu

RR98

Tato zkouška se provádí s léčivými látkami, pomocnými látkami, léčivými přípravky a zdravotnickými prostředky, u nichž je lékopisem předepsána sterilita. Vyhovující výsledek však pouze udává, že zkoušený vzorek není znečištěn žádným mikrobem zjistitelným v podmínkách zkoušky. Seznam dalších požadavků k prokázáni sterility celé šarže je uveden na konci tohoto textu.

Opatření proti mikrobiálnímu znečištění

Zkouška na sterilitu se provádí za aseptických podmínek, např. použitím laminárního boxu o třídě čistoty A umístěného v místnosti vyhovující třídě čistoty B, nebo v izolátoru. Opatření přijatá proti kontaminaci nepůsobí na mikroorganismy, které se mají při zkoušce zjistit. Pracovní podmínky, v nichž je zkouška prováděna, se pravidelně monitorují vhodným vzorkováním pracovního prostředí a provádějí se vhodné kontroly, jak jsou popsány v příslušných směrnicích Evropského společenství a v navazujících Notes for guidance on GMP.

Živné půdy

Následující živné půdy byly shledány vhodnými pro zkoušku na sterilitu. Thioglykolanová půda je především určena pro kultivaci anaerobních bakterií, ale umožní zjistit také aerobní bakterie. Půda z hydrolyzátů soji a kaseinu je především určena pro kultivaci aerobních bakterií, ale je vhodná i pro kultivaci hub. Mohou se používat i jiné živné půdy, pokud prokazatelně podporují růst široké řady mikroorganismů.

Thioglykolanová půda

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2.

Smíchá se L-cystin, agar, chlorid sodný, glukosa, kvasničný výtažek a pankreatický hydrolyzát kasinu s vodou a zahřívá se, dokud se nerozpustí. Přidá se thioglykolan sodný nebo kyselina thioglykolová do roztoku a přidá se, je-li třeba, hydroxid sodný 1 mol/l RS tak, aby roztok po sterilizaci měl pH 7,1 ± 0,2. Je-li zapotřebí filtrace, zahřeje se roztok téměř až k varu a za tepla se filtruje navlhčeným filtračním papírem. Potom se přidá roztok sodné soli resazurinu, promíchá se a rozplní do vhodných nádob, které zajistí takový poměr povrchu k výšce sloupce půdy, aby se do konce inkubační doby nezměnilo pohlcováním kyslíku barevně víc, než horní třetina půdy. Používá se validovaný postup sterilizace. Uchovává se při teplotě 2 °C až 25 °C ve sterilních, utěsněných nádobách, není-li určen a k okamžitému použití. Je-li třeba, regeneruje se půda těsně před použitím, např. 20 min zahříváním ve vodní lázni a rychlým ochlazením. Nesterilní vzduch se přitom nesmí dostat do nádoby.

Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2.

Pevné látky se za mírného zahřátí rozpustí ve vodě a roztok se ochladí na pokojovou teplotu. V případě potřeby se přidá hydroxid sodný 1 mol/l RS tak, aby roztok měl po sterilizaci pH 7,3 ± 0,2. Je-li třeba, filtruje se do vyjasnění, rozplní se do vhodných nádob a sterilizuje se validovaným postupem. Uchovává se při teplotě mezi 2 °C až 25 °C ve sterilních, utěsněných nádobách, pokud není určena pro okamžité použití.

Užité půdy, ať již ty výše popsané nebo jiné, vyhovují následujícím zkouškám provedeným před zkouškou zkoušeného přípravku nebo současně s ní.

Sterilita. Vzorky živné půdy se 14 dní inkubují při teplotách podle tabulky 2.6.1-1. Není pozorován růst mikroorganismů.

Růstová zkouška aerobních a anaerobních bakterií a hub. Části vybrané půdy se naočkují malým počtem jednoho typu mikroorganismu (10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie), který je uveden v tabulce 2.6.1-1, a inkubují se za podmínek podle této tabulky nejdéle 3 dny v případě bakterií a nejdéle 5 dní v případě hub. Rody a kmeny uvedené v tabulce nejsou jediné, které lze použít; jiné mikroorganismy mohou být také vhodné.

Použije se metoda výchozí kultury (systému jednotné inokulace), takže živé mikroorganismy užité pro očkování nejsou vzdáleny o více než pět generací od původní výchozí kultury. Půdy jsou vhodné tehdy, objeví-li se jasně viditelný časný růst mikroorganismů.

Validační zkouška

Pro každý typ mikroorganismu uvedený v tabulce 2.6.1-1 se provede zkouška, jak je popsáno dále v odstavci Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku. Užije se přesně stejná metoda s výjimkou následujících modifikací.

Membránová filtrace

Po převedení obsahu zkoušené nádoby nebo nádob na membránu se přidá inokulum malého množství živých mikroorganismů (je vhodné 10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie) do poslední části sterilního promývacího roztoku.

Tab. 2.6.1-1 Mikroorganismy vhodné pro růstovou a validační zkoušku

^*V této půdě se pomnožuje též Baccilus subtilis (ATCC 6633 nebo CIP 52,62)

Přímé očkování

Po převedení obsahu zkoušené nádoby nebo nádob do živné půdy se přidá inokulum malého množství živých mikroorganismů (je vhodné 20 až 100 jednotek vytvářejících kolonie).

V obou případech se provede růstová zkouška jako pozitivní kontrola. Všechny nádoby s živnou půdou se inkubují při teplotách podle tabulky 2.6.1-1 po dobu nejvýše 3 dnů pro bakterie a 5 dnů pro houby.

Dojde-li k jasně viditelnému časnému růstu, vizuálně srovnatelnému s růstem v kontrolních nádobkách bez zkoušeného přípravku, potom přípravek nemá v podmínkách zkoušky žádný protimikrobní účinek nebo takový účinek byl uspokojivě vyloučen. Zkouška na sterilitu se pak může provést bez dalších modifikací.

Nedojde-li v přítomnosti zkoušeného přípravku k jasně viditelnému časnému růstu, vizuálně srovnatelnému s růstem v kontrolních nádobkách bez zkoušeného přípravku, přípravek má protimikrobní účinek, který nebyl v podmínkách zkoušky uspokojivě vyloučen. Podmínky zkoušky se upraví tak, aby byl protimikrobní účinek odstraněn a zkouška se opakuje.

Tato validace se provádí:

1. má-li se na sterilitu zkoušet nový přípravek,
2. kdykoliv se změní experimentální podmínky zkoušky.

Validace se může provést současně se zkouškou na sterilitu zkoušeného přípravku, ale před hodnocením výsledku této zkoušky.

Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku

Zkouška se může provést metodou membránové filtrace nebo přímým očkováním zkoušeného přípravku do živné půdy. Vhodné negativní kontroly jsou obsaženy v každém případě. Všude tam, kde to povaha přípravku dovolí, tj. u filtrovatelných vodných, lihových nebo olejových přípravků, u přípravků mísitelných nebo rozpustných ve vodných nebo olejových rozpouštědlech, které samy v podmínkách zkoušky nemají žádný protimikrobní účinek, se použije metoda membránové filtrace.

Membránová filtrace

Použijí se membránové filtry s jmenovitou velikostí pórů nejvýše 0,45 µm, jejichž účinnost zadržet mikroorganismy byla ověřena. Filtry např. z dusičnanů celulosy se používají pro vodné, olejové a slabě lihové roztoky, filtry z octanu celulosy se používají pro silně lihové roztoky. Pro určité přípravky, např. antibiotika, mohou být zapotřebí speciální filtry.

Dále popsaná metoda je určena pro filtry o průměru 50 mm. Pokud se použijí filtry jiného průměru, měly by se jim přizpůsobit objemy zřeďovacího i promývacího roztoku. Filtrační přístroj a membránové filtry se sterilizují vhodnými postupy. Přístroj je upraven tak, aby zkoušený roztok mohl být do něho naplněn a filtrován za aseptických podmínek a aby umožnil vyjmutí membránového filtru a jeho přenesení do živné půdy nebo aby bylo možné provést inkubaci po přidání živné půdy do přístroje.

Vodné roztoky. Je-li to vhodné, přenese se na membránový filtr malé množství vhodné sterilní tekutiny, jako např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l} o pH 7,1 ± 0,2, a zfiltruje se. Tekutina může obsahovat vhodné neutralizační anebo inaktivační látky, např. v případě antibiotik.

Na membránový filtr nebo filtry se přenese obsah zkoušené nádoby nebo nádob, a je-li třeba, zředí se na asi 100 ml vybraným sterilním rozpouštědlem, v každém případě se však použije nejméně množství předepsané v tabulce 2.6.1-2 a ihned se zfiltruje. Membránový filtr se nejméně třikrát stejnou rychlostí promyje vybraným sterihúm rozpouštědlem, jehož množství je stejné jako při validační zkoušce. Membránový filtr se přenese do živné půdy nebo se asepticky rozdělí na dvě stejné části a každá z nich se přenese do vhodné půdy. Užije se stejný objem půdy jako při validační zkoušce. Lze též nalít půdu na membránu v přístroji. Pokud není předepsáno jinak, inkubují se půdy určené zejména k průkazu bakterií při teplotě 32,5 °C ± 2,5 °C a půdy určené zejména k průkazu hub při 22,5 °C ± 2,5 °C a to vždy nejméně 14 dní.

Rozpustné pevné látky. Na každou živnou půdu se použije nejméně podle tabulky 2.6.1-2 určené množství zkoušené látky, které se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, jako např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (l g/l), a dále se postupuje stejně jako u vodných roztoků za použití membránového filtru vhodného pro zvolené rozpustidlo.

Oleje a olejové roztoky. Na každou živnou půdu se použije nejméně podle tabulky 2.6.1-2 určené množství zkoušené látky. Oleje a olejové roztoky s dostatečně nízkou viskozitou se bez ředění filtrují přímo suchým membránovým filtrem. Viskózní oleje se mohou zředit vhodným sterilním ředidlem, jako je isopropyhnyristat, u něhož je prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinky. Olej se nechá pronilmout membránovým filtrem vlastní tíhou a tlak nebo sání se nastavuje postupně. Membránový filtr se promyje nejméně třikrát stejnou rychlostí asi 100 ml vhodného sterilního roztoku, jako je např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (l g/l), obsahující 1 g/l(p-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol nebo 10 g/l polysorbátu 80. Membránový filtr nebo filtry se přenesou do živné půdy nebo živných půd nebo naopak se k nim půda přidá, jak je uvedeno u vodných roztoků, a inkubují se při stejných teplotách po stejnou dobu.

Masti a krémy. Na každou živnou půdu se použije množství přípravku uvedené v tabulce 2.6.1-2. Masti s hydrofobním základem a emulze typu v/o se mohou ředit až na 1% koncentraci isopropylmyristatem, jak je popsáno výše, a zahřívat, pokud je to nutné, na nejvýše 40 °C. Výjimečně je lze, pokud je to nutné, zahřát až na 44 °C. Zfiltruje se tak rychle, jak je to jen možné, a postupuje se, jak je popsáno u olejů a olejových roztoků.

Přímé očkování do živných půd

Do živné půdy se dá takové množství zkoušeného přípravku, jak je předepsáno v tabulce 2.6.12 tak, aby objem vzorku nečinil více než 10 % objemu živné půdy, není-li předepsáno jinak.

Olejové kapaliny. Použijí se živné půdy, k nimž se přidá roztok polysorbátu 80 (10 g/l) nebo (p-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol (1 g/l) nebo jiné emulgující látky ve vhodné koncentraci, u níž bylo prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek.

Masti a krémy. Zředí se v poměru 1 : 10 vhodným emulgátorem ve sterilním rozpouštědle, např. neutrálním roztoku masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l). Zředěný přípravek se očkuje do živné půdy, která neobsahuje emulgující látku.

Má-li zkoušený přípravek protimikrobní účinky, provede se zkouška po neutralizaci vhodnou neutralizační látkou nebo po zředění dostatečným množstvím živné půdy. Je-li nutné použít větší objem pripravku, lze dát přednost použití koncentrované živné půdy připravené tak, aby se dosáhlo potřebného zředění. V některých případech lze koncentrovanou živnou půdu přímo přidat k přípravku v jeho obalu.

Pokud není předepsáno jinak, inkubují se naočkované půdy nejméně 14 dní při teplotách uvedených v tabulce 2.6.1-1. V průběhu inkubace se půdy několikrát prohlížejí. Půdy s olejovými přípravky se každý den opatrně protřepou. Pokud se však použije k důkazu anaerobů thioglykola nová nebo jí podobná půda, je nutno omezit třepání nebo míchání na minimum, aby byly zachovány anaerobní podmínky.

Odečítání a hodnocení výsledků

V živných půdách se v průběhu a na závěr inkubace makroskopicky zjišfuje případný růst mikrobů. Jestliže zkoušený přípravek způsobí zakalení živné půdy, takže nelze určit přítomnost nebo absenci mikrobiálního růstu vizuálně po 14 dnech od začátku inkubace, přenese se vhodná část živné půdy do nové nádobky se stejnou živnou půdou. Pokračuje se v inkubaci původního i nového vzorku nejméně 14 + 7 dní od původního očkování.

Jestliže není pozorován žádný růst, vyhovuje zkoušený přípravek zkoušce na sterilitu. Je-li zjištěn růst, přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu, pokud nelze jasně prokázat, že zkouška byla neplatná z důvodů, jež se nevztahují na zkoušený přípravek. Zkouška může být považována za neplatnou, je-li splněna jedna nebo více z následujících podmínek:

1. údaje o mikrobiologické kontrole prostředí, ve kterém jsou prováděny zkoušky na sterilitu, odhalí chybu,
2. prověření testovacího postupu užitého během předmětné zkoušky odhalí chybu,
3. mikrobiální růst se objeví v negativních kontrolách,
4. po identifikaci mikroorganismů izolovaných zkouškou může být růst tohoto nebo těchto druhů jednoznačně připsán chybám materiálu nebo metody užitých při provádění zkoušky na sterilitu.

Je-li zkouška prohlášena za neplatnou, opakuje se se stejným množstvím jednotek jako původní zkouška.

Jestliže při opakování zkoušky není pozorován žádný růst, vyhovuje zkoušený pripravek zkoušce na sterilitu. Je-li při opakované zkoušce zjištěn růst, přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu.

Postup zkoušky pro parenterální, oční a jiné neinjekční přípravky, u nichž je požadována sterilita

Pokud se použije metoda membránové filtrace, zkouší se, pokud možno, celý obsah nádoby, ale nejméně množství uvedené v tabulce 2.6.1-2. Je-li třeba, zředí se asi na 100 ml vhodným sterilním roztokem, např. neutrálním roztokem masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l). Celkový objem filtrovaný jedním filtrem nepřesahuje 1000 ml, není-li uvedeno a schváleno jinak.

Použije-li se metoda přímého očkování do živné půdy, očkuje se množství podle tabulky 2.6.1-2. Zkoušky na bakteriální a houbovou sterilitu se provádějí se stejným vzorkem zkoušeného přípravku. Pokud objem nebo množství v jedné nádobě nestačí k provedení obou zkoušek, použije se obsah dvou nebo více nádob k naočkování různých půd.

Je-li obsah přípravku v obalu větší než 100 ml, použije se membránová metoda, není-li uvedeno a schváleno jinak.

Tab. 2.6.1-2 Zkouška na sterilitu - množství zkoušeného přípravku

Pokyny k použití zkoušky na sterilitu

Účel zkoušky na sterilitu, jako ostatně všech lékopisných zkoušek, je poskytnout nezávislému kontrolujícímu analytikovi prostředky k ověření, že jednotlivý materiál splňuje požadavky lékopisu. Výrobci nejsou povinni provádět takové zkoušky, ani vyloučit užití modifikací nebo alternativ popsaných metod za předpokladu, že jsou přesvědčeni o tom, že bude-li přípravek zkoušen oficiálními metodami, vyhoví požadavkům lékopisu.

Pokyny pro výrobce

Stupeň jistoty získaný uspokojivým výsledkem zkoušky na sterilitu (nepřítomnost kontaminovaných jednotek ve vzorku) a vztažený na kvalitu celé šarže, je funkcí stejnorodosti podmínek výroby a efektivnosti přijatého systému odebírání vzorků. Pro účely tohoto textu je šarže defino vána jako homogenní soubor těsně uzavřených obalů připravených takovým způsobem, že riziko kontaminace je stejné pro každou jednotku v tomto souboru obsaženou.

Pokud se přípravek sterilizuje v uzavřených konečných obalech, vyšší stupeň záruky než provedení zkoušky na sterilitu poskytuje sledování správného průběhu sterilizace celé šarže pomocí měření a automatického zaznamenávání hodnot biologicky opodstatněných fyzikálních parametrů. Podmínky, za kterých může být považováno za vhodné parametrické uvolnění, jsou popsány ve stati 5.1.1-Metody přípravy sterilních přípravků. Pro vyhodnocení postupu aseptické výroby může být použita metoda, při níž se tento postup napodobí za použití živných půd. Nehledě k tomu, že zkouška na sterilitu je jediná analytická metoda použitelná pro přípravky vyrobené v aseptických podmínkách, je to dále v každém případě jediná dostupná analytická metoda pro autority, které mají vzorky přípravků zkoušet na sterilitu.

Pravděpodobnost detekce mikroorganismů zkouškou na sterilitu roste s jejich počtem ve zkoušeném vzorku a kousá podle schopnosti růstu přítomných mikroorganismů. Pravděpodobnost odhalení velmi nízkého stupně kontaminace, i když je homogenní v celé šarži, je velmi malá. Interpretace výsledků zkoušky na sterilitu se opírá o předpoklad, že obsahy všech obalů v šarži, pokud by byly zkoušeny, daly by stejný výsledek. Jelikož je zřejmé, že každý obal nemůže být zkoušen, je třeba přijmout vhodný plán odběru vzorků. Vodítko pro minimální počet jednotek doporučených ke zkoušení ve vztahu k velikostí šarže je v tabulce 2.6.1-3 a vychází z předpokladu, že pripravek byl vyroben za podmínek určených k vyloučení kontaminace. Aplikace doporučení musí brát ohled na objem pripravku v obalu, na validaci sterilizační metody a na jiné speciální zřetele týkající se sterility přípravku.

Tab. 2.6.1.-3 Doporučený nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu

(*) Stačí-li obsah jednoho obalu k inokulaci dvou půd, pak tento sloupec udává počet obalů potřebných pro obě půdy dohromady