2.6.10 Zkouška na přítomnost histaminu

Podstata zkoušky. Přítomnost znečištěnin ýpu histaminu ve zkoušeném přípravku vyvolá na izolovaném tenkém střevě morčete kontrakce, které se porovnávají s účinkem standardu (histaminiumdichloridu).

Příprava zvířete. Ke zkoušce se použije zdravé morče o hmotnosti 250 g až 350 g, které bylo předchozích 24 h ponecháno bez krmiva. Po usmrcení vykrvácením se odejme distální část tenkého střeva v délce 2 cm a vymyje se šetrně pomocí střílcačlcy roztokem B, zahřátým na teplotu 34 °C až 36 °C. Na oba konce střevního segmentu se připevní tenká nit, kterou se prošije střevní stěna tak, aby střevo zůstalo průchodné. Jeden konec střeva se touto nití připevní ke skleněnému nosiči a vloží se na dno orgánové lázně o objemu 10 ml až 20 ml naplněné roztokem B, který je udržován na stálé teplotě 34 °C až 36 °C a probublává se směsí 95 % (V/V) kysliku a 5 % (U/i~ oxidu uhličitého. Druhý konec střeva se napojí na izotonický snímač lcontralccí, které se registrují pomocí kymografu nebo jiným vhodným kontinuálním zapisovačem při zvětšení přibližně dvacetinásobném. Napnutí střeva má být asi 9,8 mN (1 g) a mělo by být upraveno podle citlivosti orgánu.

Příprava roztoků.

RoztokA: chlorid sodný 160,0 g

Chlorid draselný 4,0 g

Chlorid vápenatý bezvodý 2,0 g

Chlorid hořečnatý bezvodý 1,0 g

Hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát 0,10 g

Voda na injekci do 1000,0 ml

RoztokB: roztokA 50,0 ml

Atropiniumsulfat 0,0005 g

Hydrogenuhličitan sodný 1,0 g

Glulcosa monohydrát 0,5 g

Voda na injekci do 1000,0 ml Roztok B se má připravovat vždy čerstvý pro spotřebu do 24 h. Porovnávací roztok. Jako porovnávací roztok se používá roztok histaminiumdichloridu R o doporučené koncentraci 0,1 mg/ml. Připraví se vždy čerstvý.

Provedení zkoušky. Orgánová lázeň se vypláchne roztokem B a nechá se 10 min stabilizovat. Po následném dvoj- až trojnásobném propláchnutí roztokem B se vyvolají stahy střeva přidáváním roztoku histaminiumdichloridu R v objemech mezi 0,2 ml až 0,5 ml, aby se zjistila dávka, která způsobí reprodukovatelnou submaximální kontrakci. Tato dávka se nazývá "dávka vysoká". Před každým přidáním histaminu se lázeň třikrát propláchne roztokem B (kontinuálním průtokem bez vyprázdnění lázně). Dávky se aplikují v pravidelných intervalech umožňujících úplnou relaxaci střevního segmentu (asi 2 min).

Po zjištění "vysoké dávky" se určuje dávka zvaná "nízká" tím, že se do lázně přidává roztok histaminiumdichloridu R ve větším zředění (ale ve stejných objemech) tak, aby se dosáhla reprodukovatelná kontrakce střevního segmentu přibližně poloviční ve srovnání s dávkou "vysokou".

V dalším postupu se pravidelně střídá podávání "vysoké" a "nízké" dávky roztoku histaminu s podáním zkoušené látky, jejíž koncentrace se upravuje tak, aby vyvolaná kontrakce střeva (pokud je vůbec pozorovatelná) byla menší než stah po "vysoké dávce" histaminu. Kontrakce střeva po zkoušené látce mají být reprodukovatelné a velikost stahů po "vysoké" i "nízké" dávce histaminu má v průběhu sledování zůstat nezměněna.

Zhodnocení výsledků. Ze srovnání velilcosti kontrakce střeva po podání zkoušené látky s kontrakcemi dosaženými po "vysoké" a "nízké" dávce histaminu se provede odhad obsahu histaminové účinnosti ve zkoušené látce, vyjádřený v mikrogramech báze histaminu. Tato hodnota nemá přesáhnout limit uvedený v lékopisném článku.

Jestliže zkoušený roztok nevyvolá žádný stah střeva, připraví se čerstvý roztok zkoušené látky s přidaným histaminem v množství, které představuje povolené maximum pro zkoušenou látku podle lélcopisného článku, a pozoruj e se, zda po přidání do lázně odpovídá kontrakce střeva přidanému histaminu. Jestliže tomu tak není nebo není-li lcontralcce, vyvolaná zkoušeným roztokem reprodukovatelná nebo jsou-li následné odpovědi na "vysokou" a "nízkou" dávku histaminu sníženy, výsledky zkoušky nejsou hodnotitelné a provede se Zkouška na hypotenzivní látky (2. 6.11).