2.6.14 Bakteriální endotoxiny.

2001

Pět metod uvedených v tomto článku je určeno ke zjištění, zda koncentrace endotoxinu v přípravku, který má v lékopise článek obsahující limit pro bakteriální endotoxiny, vyhovuje tomuto limitu. Výrobci, kteří mají v úmyslu se přesvědčit, zda-li např. jejich výrobní postupy snižují koncentraci endotoxinu v přípravku během vyroby, nejsou vázáni postupy uvedenými v tomto článku.

Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny se používá lyzát z amebocytů ostrorepa, Limulus polyphemus (LAL test). Po přidání roztoku s obsahem endotoxinů k roztoku lyzátu vzniká ve směsi zákal, sraženina, nebo gel. Rachlost reakce závisí na koncentraci endotoxinu, hodnotě pH a teplotě. K reakci je nutná přítomnost určitých dvojmocných kationtů, enzymatický komplex podporující srážení a sráživý protein, které jsou obsaženy v lyzátu. Štěpení chromogenního peptidu v roztoku lyzátu po aktivaci endotoxiny obsaženými v roztoku lze též použít ke stanovení koncentrace endotoxinů z koncentrace uvolněného barviva.

V této kapitole je popsáno pět následujících metod:

Jestliže je v článku uvedena zkouška na endotoxiny bez uvedení metody, provede se zkoušení gelovou metodou A, která byla pro přípravek validována. Jinak se zkouška provádí metodou validovanou pro přípravek a uvedenou v článku.

V článcích jsou uvedeny požadavky na bakteriální endotoxiny jako limitní koncentrace endotoxinu; přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže neobsahuje více endotoxinu, než je limitní koncentrace. Splnění tohoto požadavku může být ale doloženo jedině důkazem, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než limitní koncentrace endotoxinu.

Zkouška se provádí způsobem, který vylučuje mikrobiální kontaminaci

Před provedením zkoušky na endotoxiny na zkoušeném přípravku je nutno ověřit:

• zda použité zařízení neabsorbuje endotoxiny
• hodnotu lambda (λ) použitého lyzátu. Lambda je definována jako deklarovaná citlivost lyzátu uvedená na obalu (gelová metoda), nebo nejnižší koncentrace endotoxinu použitá při přípravě standartní křivky (kvantitativní metoda).
• nepřítomnost interferujících faktorů

Je-li třeba, očistí se laboratorní zařízení od endotoxinů.

Není-li v článku pro přípravek, který je analyzován, uvedeno jinak, uplatňují se u všech pěti metod stejné požadavky popsané metodou A až metodou E.

V této stati jsou označením zkumavka míněny všechny druhy nádob, včetně jamek mikrotitrační destičky

Ve zkoušce se používá tento referenční přípravek a tato zkoumadla.

Referenční endotoxin BRP. Je kalibrován v mezinárodních jednotkách (m.j.) porovnáním s mezinárodním standardem.