2.6.16 Důkaz cizích antigenů v humánních virových vakcínách.

R99

1998

Pokud tyto zkoušky vyžadují nejprve neutralizaci viru, použijí se specifické protilátky, které nejsou humánního ani opičího původu: jestliže byl virus pomnožen na tkáni ptačího původu, nemohou to být ani protilátky ptačího původu. K přípravě antiséra se užívá imunizační antigen pri pravený na buněčné kultuře z odlišného druhu, než je kultura užívaná pro přípravu vakcíny a prosté cizích agens. Jestliže je předepsáno použití SPF vajec, tato vejce se získavají z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2).

Virové inokulum

Vzorky virového inokula se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovávají se při teplotě nižší než -40 °C.

Dospělé myši. Každé z nejméně deseti dospělých myší o hmotnosti 15 g až 20 g se vstříkne intracerebrálně 0,03 ml a intraperitoneálně 0,5 ml virového inokula. Myši se pozorují nejméně 21 dní. U všech myší uhynulých po uplynutí prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti dospělým myším, které se pozorují 21 dní. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádná myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných myší.

Sající myši. Každé z nejméně dvaceti myší mladších než 24 h se vstříkne intracerebrálně 0,01 ml a intraperitoneálně 0,1 ml virového inokula. Myši se pozorují denně nejméně 14 dní. U všech myší uhynulých po uplynutí prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti sajícím myším, které se denně pozorují 14 dní. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádná sající myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných sajících myší.

Morčata. Nejméně pěti morčatům o hmotnosti 350 g až 450 g se vstříkne intraperitoneálně po 5 ml virového inokula. Zvířata se pozorují nejméně 42 dní, aby se odhalily všechny příznaky nemoci. U všech zvířat, která po uplynutí prvních 24 h uhynou, nebo která mají příznaky nemoci, se provede pitva s makroskopickým vyšetřením; tkáně se vyšetří mikroskopicky a kultivačně na přítomnost infekce. Zvířata, která přežila dobu pozorování, se usmrtí a vyšetří se stejným způsobem. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádné morče nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných morčat.

Virové inokulum a sklizený virus

Vzorky se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovají se při teplotě nižší než -40 °C.

Bakteriální a houbová sterilita. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Mykoplazmata. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na mykoplazmata (2.6.7).

Mykobakterie (2.6.2).5 ml vzorku se zkouší na přítomnost Mycobacterium spp. kultivačními metodami uznanými za citlivé pro detekci těchto organismů.

Zkoušky na jiná cizí agens na tkáňových kulturách. Množství neutralizovaného vzorku, jestliže není předepsáno jinak, které odpovídá 500 lidských dávek nebo 50 ml vakcíny, podle toho, co je více, se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk kontinuální linie opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže virus rostl na lidských diploidních buňkách, neutralizovaný sklizený virus se také zkouší na oddělené kultuře diploidních buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než opičím nebo lidském, naočkují se také buňky tohoto druhu, ale z odlišné šarže. Tyto buňky se kultivují při 36 °C ± 1 °C a prohližejí se 14 dní. Virové inokulum nebo sklizený virus vyhovují, jestliže žádná z buněčných kultur nevykazuje známky přítomnosti jakéhokoli cizího agens, jež nelze přičíst náhodné kontaminaci. Zkoušku lze hodnotit, jestliže přežívá nejméně 80 % buněčných kultur.

Ptačí viry (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Neutralizuje se množství vzorku odpovídající buď 100 lidským dávkám, nebo 10 ml, podle toho, co je více. Na jedno kuřecí embryo se použije 0,5 ml. Skupina oplozených SPF vajec 9 až 11 dní starých se inokulume alantoidní cestou a druhá skupina, 5 až 7 dní starých, do žloutkového vaku. Inkubuje se 7 dní. Virové inokulum nebo sklizený virus vyhovují, jestliže alantoidní tekutiny ani tekutiny žloutkového vaku nevykazují přítomnost hemaglutinačního agens a jestliže všechna embrya a chorioalantoidní membrány makroskopicky vyšetřené, jsou normální. Zkoušku lze hodnotit, jestliže nejméně 80 % embryí přežije 7 dní.

Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky

Aby se ověřila nepřítomnost virů způsobujících cytopatickou degeneraci, posuzují se kontrolní buňky mikroskopicky buď po celou dobu inkubace, nebo po nejméně 14 dní od naočkování výrobních nádob, podle toho, která doba je delší. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % kontrolních kultur.

Po 14 dnech nebo v čase poslední sklizně, podle toho, které období je delší, se provedou dále popsané zkoušky.

Zkouška na hemadsorbujicí viry. Nejméně 25 % kontrolních kultur se zkouší na přítomnost hemadsorbujících virů přidáním morčecích červených krvinek. Jestliže jsou morčecí krvinky skladovány, uchovávají se nejdéle 7 dní při 5 °C ± 3 °C. Polovina kultur se odečítá po 30 min inkubace při 5 °C t 3 °C, druhá polovina po 30 min inkubace při 20 °C až 25 °C. Nezjistí se přítomnost hemadsorbujících agens.

Zkouška na jiná cizí agens v tkáňových kulturách. Směs supernatantních tekutin z kontrolních buněk se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než opičím nebo lidském, naočkují se také buňky tohoto druhu, ale z odlišné šarže. V každém buněčném systému se zkouší nejméně 5 ml. Naočkované kultury se inkubují při 36 °C ± 1 °C a pozorují se 14 dní. Nezjistí se přítomnost cizího agens.

Jestliže se kultura produkčních buněk uchovává při jiné teplotě než 36 °C ± 1 °C, provede se doplňující zkouška na cizí agens pň produkční teplotě na buňkách stejného typu, jaký se použil pro pomnožení viru.

Viry ptačí leukóry (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Zkouška na viry ptačí leukózy se provede s 5 ml supematantní tekutiny z kontrolních buněk.

Kontrolní vejce

Hemaglutinační agens. 0,25 ml alantoidní tekutiny z každého vejce se zkouší na přítomnost hemaglutinačního agens přímým smísením s kuřecími červenými krvinkami. Po pasáži na SPF vejcích se postupuje takto: 5 ml vzorku ze směsi amniových tekutin z kontrolních vajec se naoč kuje po 0,5 ml do alantoidních dutin a do amniových dutin SPF vajec. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se v žádné z obou zkoušek nezjistí známky pritomnosti hemaglutinačních agens.

Viry ptačí leukóry. Použije se 10 ml směsné amniové tekutiny z kontrolních vajec. Provede se rozhojnění pěti pasážemi na buněčných kulturách z kuřecích embryí, které prokazatelně neobsahují viry ptačí leukózy; zkouška na přítomnost ptačí leukózy se provede použitím buněk z páté pasáže. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se zkouškou neprokážou žádné známky přítomnosti viru ptačí leukózy.

Ostatní cizorodá agens. 5 ml směsné amniotické tekutiny z kontrolních vajec se naočkuje do lidských a opičích buněčných kultur. Buněčné kultury se pozorují 14 dní. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se nezjistí přítomnost cizích agens. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % naočkovaných kultur.