2.6.17 Zkouška antikomplementární účinnosti imunoglobulinu.

Podstata zkoušky. Pro měření antikomplementární účinnosti (ACA) imunoglobulinu se inkubuj e definované množství zkoušeného materiálu (10 mg imunoglobulinu) s definovaným množstvím morčecího komplementu, které je 20 CH so a stanoví se zbývající komplement. Antilcomplementární účinnost je vyjádřena jako procenta spotřeby komplementu vzhledem ke kontrole komplementu, která je 100 %.

Hemolytická jednotka účinnosti komplementu (CH sď je množství komplementu, které za daných podmínek reakce způsobí lýzu 2,5 . 108 z celkových 5 . 108 optimálně senzibilizovaných erytrocytů.

Zásobní roztok hořčíku a vápníku. 1,103 g chloridu vápenatého R a 5,083 g chloridu hořečnatého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.

Zásobní tlumivý roztok barbitalový. 207,5 g chloridu sodného R a 25,48 g barbitalu rodné soli R se rozpustí ve 4000 ml vody R a upraví se hodnota pH kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na 7,3. Přidá se 12,5 ml zásobního roztoku hořčíku a vápníku a zředí se vodou R na 5000 ml. Zfiltruje se membránovým filtrem (póry velikostí 0,22 /, ~m) a uchovává se ve skleněných nádobách při 4 °C.

Roztokželatiny. 12,5 g želatiny R se rozpustí v asi 800 ml vody R a zahřeje se na vodní lázni k varu. Ochladí se na 20 °C a zředí vodou R na 10 l. Filtruje se membránovým fitrem (póry velilcosti 0,22µm). Uchovává se při 4 °C. Používá se jen čirý roztok.

Citronanový roztok. 8,0 g citronanu sodného R, 4,2 g chloridu sodného R a 20,5 g glukosy R se rozpustí v 750 ml vody R Roztokem kyseliny citronové R (100 g/l) se upraví hodnota pH na 6,1 a zředí se vodou R na 1000 ml.

Tlumivý roztokželatino-barbitalový. Smíchají se 4 objemové díly roztoku želatiny a 1 objemový díl zásobního tlumivého roztoku barbitalového. Je-li to nutné, upraví se hydroxidem sodným 1 mol/l RS nebo kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS pH na hodnotu 7,3. Uchovává se při 4 °C. Denně se připravuje čerstvý roztok. Stabilizovaná beraní krev. Odebere se 1 objemový díl beraní lave do 1 objemového dílu citronanového roztoku a promíchá se. Uchovává se při 4 °C nejméně 7 dní a nejvýše 28 dní. (Stabilizovaná beraní krev a beraní erytrocyty jsou dostupné od řady výrobců).

Hemolyzin. Antisérum proti beraním erytrocytům připravené na králících. (Taková antiséra jsou dostupná od řady výrobců.)

Morčecí komplement. Připraví se směs sér z krve alespoň deseti morčat. Ze sražené krve se sérum oddělí odstřed'ováním při asi 4 °C. Sérum se uchovává v malých objemech při teplotě nižší než - 70 °C.

Metoda

Příprava standardizované S~ suspenze beraních erytrocytů. Erytrocyty se odstřed'ováním odděli z přiměřeného objemu stabilizované beraní lave; buňky se nejméně třikrát promyjí tlumivým roztokem želatino-barbitalovém a připraví se 5% suspenze (U/i~ v tomto roztoku. Měření koncentrace buněk v suspenzi se provádí takto: 0,2 ml se převede do 2,8 ml vody R a lyzovaný roztok se odstřed'uje 5 min při 1000 g/l Koncentrace buněk vyhovuje, jestliže absorbance (2.2.25) vrchní vrstvy měřená při 541 nm je 0,62 f 0,01. Úprava koncentrace buněk se provádí přidáním tlumivého roztoku želatino-barbitalového podle vzorce:

V, . A Vf - 0,62 '

V němž značí:

Vf - konečný připravovaný objem, Tl, - počáteční objem,

A - absorbanci původní suspenze při 541 nm.

Upravená suspenze obsahuj e asi 1 x 109 buněk v 1 ml.

Titrace hemolyzinu. Schéma přípravy ředění hemolyzinu je uvedeno v tabulce 2.6.17-1.

Do každé zkumavky, počínaje ředěním 1 : 75, se dá 1 m15% suspenze beraních erytrocytů a promíchá se. Inkubuje se 30 min při 37 °C. Z každé zkumavky takto inkubované směsi se odeberou 0,2 ml do nové zlazmavlcy, přidá se 1,10 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového a 0,2 ml ředěného morčecího komplementu (např. 1 : 150). Provádí se dvojmo.

Jako nehemolyzovaná buněčná kontrola se připraví tři zkumavky s 1,4 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového a 0,1 ml 5% suspenze beraních erytrocytů.

Jako plně hemolyzovaná buněčná kontrola se připraví tři zkumavky s 1,4 ml vody R a 0,1 ml 5% suspenze beraních erytrocytů.

Tab. 2.6.17-1 Požadované Při raveno za oužití ředění tlumivý roztok hemolyzin hemolyzinu želatino-barbitalo ' objem ředění objem ml 1 : ml 7,5 0,65 neředěno 0,1 10 0,90 neředěno 0,1 75 1,80 7,5 0,2 100 1,80 10 0,2 150 1,00 75 1,0 200 1,00 100 1,0 300 1,00 150 1,0 400 1,00 200 1,0 600 1,00 300 1,0 800 1,00 400 1,0 1200 1,00 600 1,0 1600 1,00 800 1,0 2400 1,00 1200 1,0 3200 1,00 1600 1,0 4800 1,00 2400 1,0

Odstraní se 1 ml směsi.

Všechny zkumavky se inkubují 60 min při 37 °C a odstřed'ují se 5 min při 1000 g„. Změří se absorbance (2.2.25) vrchních vrstev při 541 nm a vypočítá se stupeň hemolýzy v každé zkumavc e v procentech ze vzorce:

V němž značí:

Aa - absorbancí zkumavek s ředěným hemolyzinem,

Ab - průměr absorbancí tří zkumavek s plnou hemolýzou, A, - průměr absorbancí tří zkumavek bez hemolýzy. Sestrojí se lineární graf: na ordinátu se nanese procentuální stupeň hemolýzy, na abscisu odpovídající převrácená hodnota ředění hemolyzinu. Z grafu se určí optimální ředění hemolyzinu. Vybere se to ředění, kde již další vzestup obsahu hemolyzinu nezpůsobuje patrné změny ve stupni hemolý zy. Toto ředění je 1 minimální hemolytická jeďnotka (1 MHLT) v 1,0 ml. Optimální hemolytické ředění hemolyzinu pro přípravu senzibilizovaných beraních erytrocytů obsahuje 2 MH[J v mililitru. Titrace hemolyzinu není hodnotitelná, jestliže maximum hemolýzy není mezi 50 % a 70 %. Není-li maximum v tomto rozmezí, je nutno titraci opakovat s více nebo méně ředěným roztokem komplementu.

Příprava optimálně senzibilizovaných beraních erytrocytů (hemolytický systém). Připraví se vhodný objem ředěného hemolyzinu, který obsahuje 2 MH[T v mililitru a stejný objem standarďizované 5% suspenze beraních erytrocytů. Ke standardizované buněčné suspenzi se přidá ředěný hemolyzin a smíchá se.Inkubuj e se 15min při 37 °C, uchovává se při 2 °C až 8 °C a použije se do 6 h. Strana 178 Sbírka zákonů č. 1 / 1998 Částka 1 178 Zkušební metody

Titrace komplementu. Připraví se vhodné ředění komplementu (např. 1 : 250) tlumivým roztokem želatino-barbitalovým a provede se dvojmo titrace podle tabullcy 2.6.17-2.

Tab. 2.6.17-2 Číslo zkumavky Objem ředěného komplementu Objem tlumivého roztoku v ml na ř. 1 : 250 želatino-barbitalového v ml 1 0,1 1,2 2 0,2 1,1 3 0,3 1,0 4 0,4 0,9 5 0,5 0,8 6 0,6 0,7 7 0,7 0,6 8 0,8 0,5 9 0,9 0,4 10 1,0 0,3 11 1,1 0,2 12 1,2 0,1 3 zkumavky s 0% hemolýzy - 1,3 3 zkumavk se 100% hemolýzou - 1,3 ml vod

Do každé zkumavky se přidá 0,2 ml senzibilizovaných beraních erytrocytů, dobře se promíchá a inkubuje se 60 min při 37 °C. Zlcumavlcy se potom ochladí v ledové lázni a odstřed'ují se 5 min při 1000 g. Změří se absorbance vrchní vrstvy při 541 nm a vypočítá se stupeň hemolýzy ( Y) ze vzorce:

A~ - A~

Ab Ai

V němž značí:

A~ - absorbancí zkumavek 1 až 12,

Ab - průměr absorbancí zkumavek se 100% hemolýzou,

A, - průměr absorbancí buněčných kontrol s 0% hemolýzou.

Na logaritmický papír se vynese Y/(1 - Y) jako abscisa proti obsahu ředěného komplementu v mililitru jako ordináta. Body se co nejlépe proloží křivka a určí se ordináta pro 50% hemolyticlcou dávku komplementu, lcde Y/(1 - Y) = 1,0. Vypočítá se účinnost v hemolyticlcých jednotkách (CHSO/ml) ze vzorce:

C C.5'

V němž značí:

Ca - převrácenou hodnotu ředění komplementu,

Ca - objem ředěného komplementu, kde došlo k 50% hemolýzy, v mililitrech, 5 - přepočítací faktor v souvislosti s počtem erytrocytů.

Zlcoušlcu lze hodnotit pouze v případě, jestliže lcřivlca mezi 15 % a 85 % hemolýzy je přímkou, jejíž sklon je 0,15 až 0,40, přeánostně 0,18 až 0,30.

Zkouška antikomplementární účinnosti. Připraví se ředění komplementu o 100 CH Seml ředěním vytitrovaného morčecího komplementu tlumivým roztokem želatino-barbitalovém. Je-li to nutné, upraví se pH zkoušeného imunoglobulinu na 7. Pro imunoglobulin o obsahu 50 mg/ml se připraví směs k inkubaci takto:

Tab. 2.6.17-3 Zkoušený imunoglobulin Kontrola komplementu dvo'mo imunoglobulin (50 mg/ml) 0,2 ml - tlumivý roztok želatino-barbitalový 0,6 ml 0,8 ml kom lemem 0,2 ml 0,2 ml Současně se zkoušeným přípravkem se provede zkouškas lidským imunoglobulinem BRP, jak je doporučeno v původním letáku referenčního přípravku pro negativní a pozitivní kontrolu antikomplementární účinnosti. Jestliže koncentrace zkoušeného imunoglobulinu kolísá kolem 50 mg/ml, přidá se větší nebo menší objem vzorku a tlumivého roztoku želatino-barbitalového, např. 0,47 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového je přidáno k 0,33 ml imunoglobulinu o obsahu 30 mg/ml -do objemu 0,8 ml. Zkumavky se uzavřou a inkubují se 60 min při 37 °C. 0,2 ml z každé inkubované směsi se přidá k 9,8 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového, aby se zředil komplement. Provede se titrace komplementu v každé zkumavce tak, jak je popsáno výše, aby se určila zbytková účinnost komplementu (viz tabulka 2.6.17-2). Antikomplementární účinnost zkoušeného přípravku ve vztahu lce kontrole komplementu, která je uvažována jako 100%, se vypočítá ze vzorce:

A -

A . 100 ,

V němž značí:

A - průměr účinnosti kontrolního komplementu (CH 5~/ml),

B - účinnost komplementu (CHS~/ml) zkoušeného přípravku.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže jsou splněny následující podmínky: - antikomplementární účinnost nalezená pro negativní a pozitivní kontrolu je v limitech stanovených v průvodním letáku referenčního přípravku, - účinnost u kontroly komplementu (a) je v rozmezí 80 CHS° až 120 CHS° v mililitru.