2.6.19 Zkouška neuronirulence vakcíny proti obrně (per os).

Opice použité v této zkoušce vyhovují požadavkům uvedeným v článku TTaccinum poliomyelitidis perorale a váží nejméně 1,5 kg. Patogenita se stanoví u opic rodu Macaca nebo Cercopithecus v porovnání s referenčním virem připraveným pro zkoušku neurovirulence inokulací do bederní oblasti centrálního nervového systému po předchozím podání vhodného sedativa, např. ketaminiumchloridu. Vzorky séra odebrané před injekcí prokazatelně neobsahují neutralizační protilátky v ředění 1 : 4 při zkoušení proti nejvýše 1000 CCID 5o každého ze tří typů polioviru.

Počet opic. Vakcína a vhodný homotypiclcý referenční virus se zkouší současně v téže skupině opic. Stejnému počtu zvířat se vstříkne zkoušená vakcína a referenční přípravek. Zvířata se rozdělí náhodně do ošetřovacích skupin a klecí a jejich totožnost se kóduje při očkování. Zařazení jednotlivých zvířat se před ošetřovatelem a pitvajícím tají. Počet naočkovaných opic je takový, aby při vyhoďnocení zkoušené vakcíny a referenčního přípravku bylo nejméně jedenáct pozitivních opic u typů 1 a 2 a nejméně osmnáct pozitivních opic u typu 3 (pozitivní opice jsou takové, které v centrálním nervovém systému mají specifické poliovirové léze neuronu). S týmž homotypickým referenčním přípravkem může být zkoušena více než jedna šarže vakcíny. Je-li to možné, použijí se opice z téže karanténní skupiny. V opačném případě se použijí opice ze dvou skupin a stejná množství z každé skupiny se použijí pro podání vakcíny a referenčního přípravku. Jestliže se zkouška provádí ve dvou pracovních ďnech, naočkuje se stejné množství opic z každé skupiny v týž den vakcínou a homotypickým referenčním přípravkem.

Obsah viru. Obsahy viru ve vakcíně a homotypickém referenčním přípravku se upraví tak, aby byly tury pokud možno stejné a v rozmezí od 105'5 do 106'5 CCID5~±0,1 ml.

Pozorování. Všechny opice se pozorují 17 až 22 ďní, aby se zjistily příznaky poliliomyelitidy nebo jiné virové infekce. Opice, které přežijí prvních 24 h, ale uhynou před jedenáctým dnem po očkování, se pitvají, aby se určilo, zda byla poliomyelitida příčinou smrti. Zvířata, která uhynula z jiných příčin, než je poliomyelitida, se vyloučí z hoďnocení. Umírající nebo těžce paralyzovaná zvířata se usmrtí a pitvají. Všechna zvířata, která přežijí do konce pozorovacího období, se též pitvají. Zkouška není platná, jestliže více než 20 % zvířat vykazuje během pozorovacího období interkurentníinfekci.

Počet vyšetřovaných řezů. Z každé opice se histologicky vyšetří nejméně bederní mícha, krční mícha a nižší i vyšší část prodloužené míchy, střední mozek, talamus a motorická oblast kůry mozkové. Zkoumají se řezy tenčí než 15 /, ~m a barvené gallocyaninem.

Nejnižší počet vyšetřovaných řezů je následující: a) 12 řezů reprezentujících celou bederní ztluštěninu, b) 10 řezů reprezentujících celou krční ztluštěninu, c) 2 řezy z prodloužené míchy,

D) 1 řez z mostu a mozečlcu, e) 1 řez ze středního mozku, f) 1 řez z levé a pravé části thalamu,

G) 1 řez z levé a pravé části motorické oblasti mozkové kůry.

Určení aktivity viru. Pro hoďnocení virové aktivity v řezech ze hr~betní míchy a mozkového kmene se používá hodnotící systém pro stupeň poškození, který rozlišuje buněčnou infiltraci a destrukci neuronů následovně: 1. pouze buněčná infiltrace (tyto opice se nepovažují za pozitivní), 2. buněčná infiltrace s minimálním poškozením neuronu, 3. buněčná infiltrace s rozsáhlým poškozením neuronu, 4. masivní poškození neuronu s buněčnou infiltrací nebo bez ní.

Výsledky se zaznamenávají do standardního formuláre.'Opice s neuronálními lézemi v řezech, které ale nevykazují stopy po vpichu, jsou počítány jako pozitivní. Opice vykazující stopy po vpichu v řezech, ale nikoli neuronální léze nej sou počítány j ako pozitivní. Řezy, které vykazuj í traumatické poškození, ale nemají žádné specifické virové léze, se nezahrnují do počtu.

Závažnost nálezu je založena na odečtení výsleďků z bederních (L), krčních (C) a mozkových (B) histologických řezů.

Ohodnocení lézí (LS) pro každou pozitivní opici se vypočítá takto:

LS -- ~ f součet hodnot Ll + součet hodnot Cl + součet hodnot Bl ~ : 3

L počet řezů) počet řezů) počet řezJů

Pro každou skupinu pozitivních opic se vypočítá průměrný počet lézí.

Hodnocení. Srovnání virové aktivity ve vakcíně a referenčním přípravku je založeno na aktivitě v bederním ztluštění míchy a stupni šíření aktivity z této oblasti do krčního ztluštění a mozku. Vhodnost nebo nevhoďnost je založena na celkovém poměru u všech zvířat ve zkoušce. Jednotlivá zvířata vykazující neobvylde vysokou aktivitu jalo v bederní oblasti, tak i v důsledku šíření z této oblasti jsou také zavzata do konečného hodnocení. Monovalentní várka vyhovuje ve zkoušce, jestliže je požadovaný počet zvířatpozitivní a žádné z histopatologických a klinických vyšetření nevykazuj e významný rozdíl v patogenitě mezi valccinačním virem a referenčním přípravkem. Podmínky vhodnosti jsou uvedeny níže.

Požadavky. S každou referenční vakcínou (typ 1,2 a 3) se provede vhodný počet neurovirulenčních kvalifikačních zlcoušelc (např. čtyři zkoušky) a získaná data o její al~tivitě slouží jako základ pro požadavky na zkoušenou vakcínu. Celkový průměrný počet lézí (NI) pro opakované zkoušky každého referenčního viru se hoďnotí společně se shromážděnými výsleďky v testu (s~ jako oďhad směrodatné odchylky (s).

Požadavky na platnost výsleďků ve zkoušce referenčního přípravku jsou stanoveny na základě kumulativních dat z kvalifikačních zkoušek. Nejsou stanoveny všeobecně platné poďmínky; pro pomoc zkoušejícím laboratořím jsou doporučeny následující empirické metody pro získání přijatelných limitů průměrného počtu lézí pro referenční přípravek (X~~. ~~ Vhodný formulář uvádějí Požadavky na perorální vakcínu proti poliomyelitidě (Requirements for Biological Substances No. 7, World Health Organisation) vydané Světovou zdravotnickou organizací. Strana 182 Sbírka zákonů č. 1 / 1998 Částka 1 182 Zkušební metoďy

Tab. 2.6.19-1 S odní limit Horní limit Typy 1 a 2 M - s M + s T 3 M-sl2 M+s

Jestliže je průměrný počet lézí ve vakcíně stanovenXt~StaC v C 2 aC s jsou konstaí~ stanovené postupem uvedeným níže, pak vakcína nevyhovuje, jestliže:

Xcst-Xcf~ Cl. Vakcína se může zkoušet znovu, jestliže:

Cl ~tcst - Xcf ~

Při opakovaném zkoušení vakcíny se přepočítává průměrný počet lézí ve zkoušené vakcíně a v referenčním přípravku. Přípravek nevyhovuje, jestliže:

X(test 1 + test 2) - X(ref 1 + ref 2)) G, s. Konstanty C, , Cz a C3 se vypočítají ze vzorců: cl -2,3.1 2s2

N '

C2 -2,6.1 2s2

N ' 2s2

Nz '

V nichž značí:

N - počet pozitivních opic ve zkoušce vakcíny, NZ - počet pozitivních opic ve dvou zkouškách, 2,3 - normální odchyllcu na 1 % hladině, 2,6 - normální odchyllcu na 0,5% hladině, 1,6 - normální odchyllcu na 5% hladině.

Zkoušku neurovirulence, v které průměrný počet lézí pro referenční přípravek (X~ není shodný s údaji z předešlých pokusů, nelze použít pro určení vhoďnosti vakcíny. Jestliže je zkouška vakcíny platná, průměrný počet lézí pro zkoušenou vakcínu (Xr~9t) lze počítat a srovnávat s homotypiclcou referenční vakcínou.