2.6.21   Techniky amplifikace nukleových kyselin

2001

1 Úvod

Techniky amplifikace nukleových kyselin jsou založeny na dvou r ozdílných přístupech:

1. amplifikace cílové sekvence nukleové kyseliny používající např. polymerasovou řetězovou reakci (PCR), ligasovou řetězovou reakci (LCR) nebo izotermální amplifikaci ribonukleové kyseliny (RNK),
2. amplifikace hybridizačního signálu, používající např. pro kyselinu deoxyribonukleovou metodu tzv. větvené DNK (bDNK). V tomto případě se amplifikace signálu docílí bez vystavení nukleové kyseliny opakovaným amplifikačním cyklům.

V této obecné stati se jako referenční technika popisuje metoda pCR. Mohou se používat alternativní metody, pokud splňují dále popsané požadavky na kvalitu.

2 Rozsah působnosti

Tato stať zavádí požadavky na přípravu vzorku, na amplifikaci sekvencí DNK in vitro a na detekci specifického produktu PCR. Za pomoci PCR se mohou detegovat definované sekvence DNK. Rovněž sekvence RNK se mohou de[egovat po reverzní transkripci RNK na komplementární DNK (cDNK) a následné amplifikaci.

3 Princip metody

PCR je postup umožňující in vitro specifickou amplifikaci segmentů DNK nebo segmentů RNK po jejich reverzní transkripci na cDNK.

Po denaturaci dvouřetězcové DNK na jednořetězcovou DNK se dva syntetické oligonukleotidové primery opačné polarity přihybridizují k odpovídajícím komplementárním sekvencím DNK, která má být amplifikována. Krátké dvouřetězcové úseky, které jsou výsledkem specifického párování mezi primery a komplementární sekvencí DNK, ohraničují segment DNK, který bude amplifikován a slouží jako výchozí body pro syntézu DNK in vitro pomocí tepelně stabilní DNK polymerasy.

Amplifikace DNK probíhá v cyklech, které tvoří:

• tepelná denaturace nukleové kyseliny (cílové sekvence) na dva jednoduché řetězce;
• specifické přihybridizování primerů k cílové sekvenci za vhodných reakčních podmínek;
• prodloužení primerů, které jsou navázány na oba jednoduché řetězce, DNK polymerasou při vhodné teplotě (syntéza DNK).

Opakované cykly tepelné denaturace, přihybridizování primerů a syntéza DNK vedou k exponenciální amplifikaci segmentu DNK omezeného primery.

Specifický produkt PCR, známý jako amplikon, může být detegován různými metodami s vhodnou specifitou a citlivostí.

4 Zkoušený materiál

Z důvodu vysoké citlivosti metody PCR je nutno vzorky optimálně chránit před vnější kontaminací cílovfmi sekvencemi. Vzorkování, uchovávání a doprava zkoušeného materiálu se provádějí za podmínek minimalizujících degradaci cílové sekvence. Pro cílové sekvence RNK je třeba zvláštní opatrnost, neboť RNK je vysoce citlivá na degradaci ribonukleasami. Je třeba věnovat pozornost i tomu, že některá přidávaná zkoumadla, jako jsou antikoagulancia nebo konzervační látky, mohou interferovat v postupu zkoušky.

5 Zkušební metoda

5.1 Zamezení kontaminace

Riziko kontaminace vyžaduje přísné oddělení prostor podle zpracovávaného materiálu a používané technologie. Faktory, které je třeba uvážit, jsou pohyb personálu, pracovní oděv, pohyb materiálu, větrání a dekontaminační postupy.

Systém se má rozdělit do několika oddělení, jako jsou např.:

• hlavní míchací prostor, prostor, kde se zachází výhradně s materiály neobsahujícími matrice (jako jsou např. primery, tlumivé roztoky atp.),
• pre-PCR-prostor (prostor, kde se zachází se zkoumadly, vzorky a kontrolami),
• PCR-amplifikace (s amplifikovaným materiálem se zachází v uzavřeném systému),
• detekce post-PCR (jediný prostor, kde se zachází s amplifikovaným materiálem v otevřeném systému).

5.2 Příprava vzorku

Při přípravě vzorku se cílová sekvence pro amplifikaci extrahuje nebo uvolňuje ze zkoušeného materiálu účinným a reprodukovatelným způsobem tak, aby bylo možné provést amplifikaci za zvolených reakčních podmínek. Mohou se použít různé způsoby fyzikálně-chemické extrakce a/nebo obohacovací metody. přísady přítomné ve zkoušeném materiálu mohou interferovat s PCR. Pro kontrolu nepřítomnosti inhibitorů pocházejících ze zkoušeného materiálu se použijí postupy uvedené v odstavci 7.3.2.

V případě matric RNK je třeba zabránit působení ribonukleasy.

5.3 Amplifikace

Amplifikace cílové sekvence metodou PCR se provádí opakovanými cykly v optimalizovaných podmínkách (teplotní profil pro denaturaci dvouřetězcové DNK, přihybridizování primerů a jejich prodlužování, inkubační časy při zvolených teplotách, rychlost nabíhání zvolených teplot).

Tyto podmínky závisejí na různých parametrech, jako jsou:

• délka a složení bází primerů a cílových sekvencí;
• typ DNK polymerasy, složení tlumivého roztoku a reakční objemy použité pro amplifikaci;
• typ použitého termocykleru a koeficient teplotní vodivosti mezi přístrojem, reakční zkumavkou a reagující tekutinou.

5.4 Detekce

Amplikon vytvořený metodou PCR se může identifikovat velikostí, sekvencí, chemickou modifikací nebo kombinací těchto parametrů. Charakterizace na základě velikostí se může dosáhnout gelovou elektroforézou (použije se vrstva agarosového nebo polyakrylamidového gelu nebo kapilární elektroforéza) nebo chromatografií na koloně (např. HPLC). Charakterizace na základě složení sekvencí se může provést specifickou hybridizací vzorků majících komplementární sekvence k cílové sekvenci nebo štěpením amplifikovaného materiálu restrikčním enzymem ve specifických místech pro cílovou sekvenci. Charakteristika chemickou modifikací se může provést např. inkorporací fluorofonz do amplikonu a následnou detekcí fluorescence po excitaci.

Detekce amplikonů se může provést použitím značených vzorků, umožňujících následnou radioizotopovou nebo imunoenzymatickou detekci.

6 Hodnocení a interpretace výsledků

Výsledky jsou platné pouze tehdy, jsou-li pozitivní kontroly jednoznačně pozitivní a negativní kontroly jednoznačně negativní. Vysoká citlivost metody PCR a potenciální riziko kontaminace vyžaduje potvrdit pozitivní výsledky dvojím opakováním celého zkušebního postupu, pokud možno s novým množstvím vzorku. Vzorek se považuje za pozitivní, jestliže alespoň jedna z opakovaných zkoušek je pozitivní.

7 Jištění jakosti

7.1 Validace systému zkoušky PCR

Validační program zahrnuje validaci přístrojů a validaci použitých metod PCR. Doporučení jsou obsažena v Předpisu ICH (hlava Q2B) Validace analytických metod: Metodologie.

Vhodné národní referenční přípravky nebo pracovní referenční přípravky se kalibrují proti mezinárodnímu standardu na cílové sekvence, pro které bude zkouška používána, a tato kalibrace je nezbytná pro validaci PCR zkoušky.

Při validaci se stanoví pozitivní limitní hodnota. Pozitivní limitní hodnota je definována jako minimální počet cílových sekvencí v objemu vzorku, které mohou být delegovány v 95 % zkušebních sérií. Pozitivní limitní hodnota závisí na vzájemně souvisejících faktorech, jako jsou objem extrahovaného vzorku a účinnost extrakční metody, přepis cílové I2NK na cDNK, amplifikační postup a detekce.

Pro stanoveni detekčního limitu zkušebního systému se uvede odkaz na pozitivní limitní hodnotu pro každou cílovou sekvenci a provedení zkoušky nad a pod tímto bodem.

7.2 Kontrola jakosti zkoumadel

Všechna zkoumadla potřebná pro metodiku se kontrolují dříve, než se běžně použijí. Jejich vhodnost nebo nepřijatelnost je dána předem definovanými kritérii jakosti.

Primery jsou klíčovou složkou zkoušky PCR a je nutné věnovat pečlivou pozornost jejich složení, čistotě a validaci jejich použití ve zkoušce pCR. Každá nová šarže primeru se před přijetím zkouší na specificitu, amplifikační účinnost a inhibiční nečistoty. Primery mohou být modifikovány (např. konjugací s fluoroforem nebo antigenem), aby umožnily použití specifické metody detekce amplikonu, a to za předpokladu, že tyto modifikace neinhibují přesnost a účinnost amplifikace cílové sekvence.

7.3 Průběžná kontrola

7.3.1 Vnější kontroly

Ke snížení rizika kontaminace a zajištění dostatečné citlivosti jsou do každé PCR zkoušky zařazeny následující vnější kontroly:

• pozitivní kontrola: obsahuje definovaný počet kopií cílových sekvencí, jejichž počet je stanoven zvlášf pro každý zkušební systém a je určen jako násobek pozitivní limitní hodnoty zkušebního systému;
• negativní kontrola: vzorek téže matrice prokazatelně neobsahující cílové sekvence.

7.3.2 Vnitřní kontroly

Vnitřní kontroly jsou definované sekvence nukleových kyselin obsahující vazebná místa pro primery. Vnitřní kontroly jsou amplifikovány s podobnou účinností jako zkoušená cílová sekvence, ale amplikony jsou jasně r ozpoznatelné. Vnitřní kontroly jsou téhož typu nukleové kyseliny (DNK/RNK) jako zkoušený materiál. Vnitřní kontrola se raději přidává ke zkoušenému materiálu před izolací nukleové kyseliny a slouží proto jako celková kontrola (extrakce, r everzní transkripce, amplifikace, detekce).

7.4 Vnější hodnocení jakosti

Účast v programech vnějšího hodnocení jakosti je důležitým postupem jištění jakosti PCR pro každou laboratoř a každého pracovníka.

Následující část je uvedena pro informaci a pouze jako pokyn: není to závazná část lékopisu.

Validace amplifikace nukleových kyselin (NAT) pro detekci RNK viru hepatitidy C (HCV) v plazmatických směsích: směrnice

1 Úvod

Většinu analytických postupů amplifikace nukleových kyselin tvoří kvalitativní zkoušky na přítomnost nukleových kyselin s některými kvantitativními zkouškami (buďto domácími, nebo komerčními), jež jsou dostupné. pro detekci kontaminace RNK HCV v plazmatických směsích postačují kvalitativní zkoušky a mohou být považovány za limitní zkoušku pro kontrolu nečistot, jak je popsáno v Technických pokynech pro vypracování článků (Pharmeuropa, prosinec 1999), Kapitola III, „Validace analytických postupů". Tyto pokyny popisují pouze metody k validaci kvalitativních analytických postupů amplifikace nukleových kyselin pro stanovení kontaminace RNK HCV v plazmatických směsích. proto jsou za nejzávažnější pro validaci analytické metody považovány specificita a detekční limit. Jako další může být hodnocena robustnost metody.

Nicméně se tento dokument může použít jako obecný základ pro validaci amplifikace nukleových kyselin.

Pro účel tohoto dokumentu se analytický postup definuje jako úplný postup od extrakce kyseliny nukleové po detekci amplifikovaných produktů.

Při použití komerčních souprav pro část postupu, nebo úplný analytický postup mohou výrobcem lotu dokumentované validační body nahradit validaci uživatelem. Působení soupravy ve vztahu k zamýšlenému užití by mělo být dokázáno uživatelem (např. detekční limit, robustnost, křížová kontaminace).

2 Specificita

Specificita je schopnost jednoznačně stanovit nukleovou kyselinu v přítomnosti složek, jejichž přítomnost je předvídatelná.

Specificita analytického postupu amplifikace nukleových kyselin je závislá na výběru primerů, výběru vzorků (pro analýzu finálního produktu) a přísnosti zkušebních podmínek (pro amplifikační i detekční kroky).

Při navrhování primerů a vzorků se ověřuje jejich specificita k detekci pouze RNK HCV srovnáním vybraných sekvencí se sekvencemi v publikovaných databankách. Pro HCV se budou primery (a vzorky) obvykle vybírat z oblasti 5' nekódující části HCV genomu, kteráje vysoce konzervativní pro všechny genotypy.

Amplifikovaný produkt by měl být jednoznačně určen použitím jedné z následujících metod, jako je amplifikace vlastními primery, restrikční enzymovou analýzou, sekvecováním nebo hybridizací se specifickým vzorkem. K validaci specificity analytických postupů se s výsledkem negativním zkouší nejméně 100 směsí plazmy HCV RNK negativních. Vhodné vzorky nereaktivních směsí jsou dostupné z Evropského ředitelství pro jakost léčiv (EDQM).

Schopnost analytických postupů k detekci všech HCV genotypů závisí opět na výběru primerů, vzorků a parametrech metody. Tato schopnost by se měla prokázat použitím charakterizovaných referenčních panelů. Vzorky některých genotypů (např. genotypu 6) je obtížné získat, nejvíce převládající genotypy (např. v Evropě 1 a 3) by měly být detegovány na příslušné úrovni.

3 Detekční limit

Detekční limit jednotlivého analytického postupu je nejnižší množství kyseliny nukleové ve vzorku, které může být detegováno, ale není nutné je kvantifikovat jako přesnou hodnotu.

Analytický postup amplifikace kyseliny nukleové použitý pro detekci r NK HCV v plazmatických směsích obvykle dává kvalitativní výsledky. Počet možných výsledků je omezen na dva, buďto pozitivní, nebo negativní. Přestože je doporučeno stanovit detekční limit, měla by se pro praktické účely analytického postupu amplifikace nukleových kyselin stanovit pozitivní limitní hodnota. pozitivní limitní hodnota (jak je definována v obecné stati (2.6.21) je minimální počet cílových sekvencí na objem vzorku, který může být detegován v 95 % zkušebních sérií. Pozitivní limitní hodnota je ovlivňována distribucí virových genomů v jednotlivých zkoušených vzorcích a také faktory, jako je enzymová účinnost, které mohou způsobit rozdíly pozitivních limitních hodnot v 95 % jednotlivých sérií analytických zkoušek.

K určení pozitivní limitní hodnoty se používají ředící série pracovních zkoumadel nebo viru hepatitidy C BRP, který je kalibrován proti mezinárodnímu standardu WHO HCV 96/790 a zkouší se v různých dnech, aby se vyzkoušely rozdíly mezi zkušebními sériemi. Zkouší se nejméně tři nezávislé ředící série s dostatečným počtem replik v každém ředění, aby se pro každé ředění získalo 24 výsledků způsobilých ke statistickému hodnocení výsledků.

Laboratoř může např. zkoušet tři ředící série v různých dnech v osmi replikách pro každé ředění, čtyři ředící série v různých dnech se šesti r eplikami pro každé ředění, nebo šest ředících sérií v různých dnech ve čtyřech r eplikách pro každé ředění. K udržení počtu ředění na zvládnutelné úrovni lze provést předběžnou zkoušku (např. s použitím logariimického ředění vzorku plazmatické směsi) k získání předběžného výsledku pro pozitivní limitní hodnotu (tj. nejvyšší ředění dávající pozitivní signál). Řada ředění může být vybrána kolem předurčené limitní hodnoty (např. s použitím ředícího faktoru 0,5 log nebo méně a negativní plazmatické směsi pro ředící matrici). Koncentrace RNK HCV, která byla detegována v 95 % zkušebních sérií, se může vypočítat vhodným statistickým vyhodnocením.

Tyto výsledky mohou sloužit rovněž k důkazu odchylek uvnitř zkoušky a mezidenních odchylek analytického postupu.

4 Robustnost

Robustnost analytického postupu je míra jeho kapacity zůstat nedotčen malými, ale záměrnými odchylkami v parametrech metody a poskytuje údaje o jeho spolehlivosti při běžném použití.

Ohodnocení robustnosti se zvažuje ve vývojové fázi. Mělo by ukázat spolehlivost analytického postupu s ohledem na záměrné odchylky v parametrech metody. Pro metody amplifikace nukleových kyselin mohou být malé odchylky v parametrech metody rozhodující. Robustnost metody se může dokázat při jejím vývoji, kdy se zkouší malé odchylky v koncentraci zkoumadel (např. chloridu hořečnatého, primerů nebo dNTP). K důkazu robustnosti se použije nejméně dvacet plazmatických směsí negativních RNK HCV (náhodně vybraných), záměrně kontaminovaných RNK HCV

do konečné koncentrace trojnásobku dříve stanovených 95 % pozitivních limitních hodnot. Výsledek zkoušky by měl být pozitivní.

Problémy s robustností mohou také vzniknout u metod, které užívají úvodní ultracentriµgaci před extrakcí virové RNK. Proto se k průkazu r obustnosti takových metod zkouší nejméně dvacet plazmatických směsí, obsahujících různá množství RNK HCV, ale bez HCV specifických protilátek, a výsledek by měl být pozitivní.

Prevence křížové kontaminace se prokáže přesnou detekcí panelu o nejméně dvaceti vzorcích, sestávajícího střídavě ze vzorků obsahujících negativní plazmatické směsi a negativní plazmatické směsi záměrně kontaminované vysokými koncentracemi HCV (nejméně stonásobek 95% pozitivní limitní hodnoty nebo nejméně 10⁴ m.j./ml).

5 Jištění jakosti

U biologické zkoušky jako je amplifikace nukleových kyselin, mohou vzniknout specifické problémy, které mohou ovlivnit validaci a interpretaci výsledků. Zkušební metody se přesně popíšou formou standardních operačních postupů, které by měly obsahovat:

• způsob vzorkování (typ obalu, atd.);
• přípravu mini-směsí (kde je to vhodné);
• podmínky uchovávání před analýzou;
• přesný popis zkušebních podmínek, včetně opatření, jak zabránit křížové kontaminaci nebo destrukci virové RNK, použitých zkoumadel a referenčních přípravků;
• přesný popis použitého přístroje;
• detailní vzorce pro výpočet výsledků, včetně statistického hodnocení.

Použití vhodné kontroly ve zkušební sérii (např. vhodné ředění viru hepatitidy C BRP nebo plazmy záměrně kontaminované vzorkem HCV kalibrovaným proti mezinárodnímu standardu WHO HCV 96/790) se považuje za uspokojivý systém vhodnosti kontroly a zajišťuje, že spolehlivost analytického postupu je zaručena, ať se provádí kdykoli.

Technická kvalifikace: je potřeba, aby pro každou podstatnou část použitého zařízení byla provedena vhodná instalace a existoval program provozní způsobilosti. Konfirmace provedení analytického postupu po změně kritického zařízení (např. termocykleru) se dokumentuje provedením paralelní zkoušky s osmi r eplikami vzorků plazmatických směsí záměrně kontaminovaných RNK HCV do konečné koncentrace trojnásobku dříve stanovených 95% limitních hodnot. Všechny výsledky jsou pozitivní.

Kvalifikace operátora: vypracuje se vhodný program kvalifikace pro každého operátora, který provádí zkoušení. Pro potvrzení úspěšného výcviku každý operátor přezkouší nejméně osm replik vzorků plazmatických směsí záměrně kontaminovaných RNK HCV, do konečné koncentrace trojnásobku dříve stanovených 95% limitních hodnot. Tato zkouška (osm replik vzorků) se opakuje dvakrát ve dvou různých dnech, tj. celkově se ve třech různých dnech provede 24 zkoušek všechny výsledky jsou pozitivní.