2.6.7 Zkouška na mykoplazmata

1998

Tam, kde je předepsána zkouška na mykoplazmata pro banku základních buněk, banku pracovních buněk, výchozí kulturu viru nebo kontrolní buňky, použije se metoda kultivační a metoda imunofluorescence v buněčné kultuře. Tam, kde je předepsána zkouška na mykoplazmata pro virovou sklizeň ve vakcíně před rozplněním nebo v šarži, použije se kultivační metoda. Metoda imunofluorescence v buněčné kultuře se může také použít, je-li třeba, k ověření půd.

KULTIVAČNÍ METODA

Výběr kultivačních půd

Zkouška se provádí za použití dostatečného počtu jak pevných, tak tekutých živných půd, aby se za vybraných podmínek inkubace zajistil růst malých počtů mykoplazmat, která mohou být přítomna ve zkoušeném přípravku.

Tekuté živné půdy obsahují fenolovou červeň. Vybrané druhy živných půd mají prokazatelně dostatečné živné vlastnosti nejméně pro organismy uvedené dále. Živné vlastnosti každé nové šarže živné půdy jsou ověřovány pro příslušné organismy uvedené na seznamu.

Acholeplasma laidlawii (vakcíny pro humánní a veterinární použití, při jejichž výrobě byla použita antibiotika)

Mycoplasma gallisepticum (kde se při výrobě použit materiál ptačího původu nebo kde vakcína je určena pro drůbež)

Mycoplasma hyorhinis (neaviární veterinární vakcíny)

Mycoplasma orale(vakcíny pro humánní a veterinární užití)

Mycoplasma pneumoniae (vakcíny pro humánní užití) nebo jiný vhodný druh, glukózu

Mycoplasma synoviae (kde se při výrobě použil materiál ptačího původu nebo určena pro drůbež)

Zkušební kmeny jsou izoláty z terénu, které neprošly více uchovávány zmrazené nebo v lyofilizovaném stavu.

Po klonování se kmeny identifikují jako požadované druhy vhodnou metodou, porovnáním se sbírkovými kulturami např.:

Inkubační podmínky

Naočkovaná živná půda se rozdělí na dvě stejné části a jedna část se inkubuje za aerobních a druhá část za mikroaerofilních podmínek; pevné živné půdy se udržují v atmosféře s patřičnou vlhkostí, aby se zamezilo vysychání povrchu půd. Za aerobních podmínek se inkubuje v atmosféře vzduchu s odpovídající vlhkostí a obsahující pro pevné půdy 5 % až 10 % oxidu uhličitého. Za mikroaerofilních podmínek se inkubuje v dusíkové atmosféře, obsahující pro pevné půdy 5 % až 10 % oxidu uhličitého.

Živné vlastnosti

S každou novou šarži živné půdy se provede zkouška živných vlastností. Vybraná živná půda se naočkuje vhodnými zkušebními mikroorganismy; použije se nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie na misku o průměru 60 mm obsahující 9 ml pevné živné půdy a nejvýše 40 jednotek vy tvářejících kolonie pro 100ml nádobu s odpovídající tekutou půdou; pro každý druh organismu se použije samostatná plotna a nádoba. Živné půdy se inkubují za podmínek, které budou použity ke zkoušce zkoušeného výrobku (aerobní, mikroaerofilní nebo obojí, v závislosti na požadavcích zkušebního organismu). Půdy vyhovují zkoušce na živné vlastnosti, dojde-li k přiměřenému růstu zkušebních organismů doprovázenému příslušnou barevnou změnou v tekutých živných půdách.

Inhibiční látky

Zkouška na živné vlastnosti se provede v přítomnosti zkoušeného přípravku. Je-li růst zkušebních organismů zřetelně menší než ten, který byl zjištěn bez přítomnosti zkoušeného přípravku, přípravek obsahuje inhibiční látky, které se před provedením zkoušky na mykoplazmata neutralizují (nebo se jejich účinek vyloučí jinak např. ředěním). Účinnost neutralizace nebo jiného postupu se kontroluje opakováním zkoušky na inhibiční látky po neutralizaci.

Zkouška na mykoplazmata ve zkoušeném přípravku

Pro pevné živné půdy se použijí misky o průměru 60 mm a obsahující 9 ml půdy. Každá z nejméně dvou misek s každou pevnou půdou se naočkuje 0,2 ml zkoušeného přípravku a 100 ml každé tekuté půdy se naočkuje 10 ml zkoušeného přípravku. Inkubuje se 21 dní při 35 °C až 38 °C za aerobních a mikroaerofilních podmínek a současně se jako kontrola inkubuje nenaočkovaná dávka 100 ml každé tekuté živné půdy. Objeví-li se po přidání zkoušeného přípravku jakékoliv významné změny pH, původní hodnota pH se obnoví přidáním roztoku buď hydroxidu sodného, nebo kyseliny chlorovodíkové. První, druhý nebo třetí den po naočkování se vyočkuje po 0,2 ml z každé tekuté půdy na dvě misky s každou pevnou půdou a inkubuje se nejméně 21 dní při 35 °C až 38 °C za aerobních a mikroaerofilních podmínek. Postup se opakuje šestý, sedmý nebo osmý den a znovu třináctý nebo čtrnáctý den zkoušky. Tekuté živné půdy se prohlížejí každý druhý nebo třetí den, a objeví-li se změna barvy, okamžitě se přeočkují. Pevné živné půdy se prohlížejí jednou tý dně.

Jestliže jsou tekuté živné půdy kontaminovány bakteriemi nebo houbami, zkouška se opakuje. Jestliže nejdříve za sedm dní po naočkování je nejvýše jedna miska v každé části zkoušky náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami nebo zničena, vyloučí se tato miska za předpokladu, že se při bezprostředním vyšetření neprokáže růst mykoplazmat. Pokud je v kterékoliv části v průběhu zkoušky více než jedna miska náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami nebo rozbita, je zkouška neplatná a opakuje se.

Do zkoušky se zařadí pozitivní kontrola připravená naočkováním nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie vhodného druhu, jako M. orale a M. pneumoniae.

Na konci inkubační doby se všechny pevné naočkované půdy mikroskopicky vyšetří na přítomnost mykoplazmat.

Přípravek vyhovuje zkoušce, nezjistí-li se růst mykoplazmat v žádné z naočkovaných půd. Zjistí-li se růst mykoplazmat, zkouška se může opakovat s použitím dvojnásobného množství inokula, půd a misek. Nezjistí-li se růst mykoplazmat, přípravek vyhovuje zkoušce. Zkouška není platná, jestliže pozitivní kontrola neprokáže růst zkušebmho mikroorganismu.

Metoda imunofluorescence v buněčné kultuře

Buněčné kultury se obarví fluorescenčním barvivem, které se váže na DNK. Mykoplazmata se zjistí pomocí fluorescence jejich charakteristických částic nebo nitkovitých útvarů na povrchu buněk, a jestliže je kontaminace silná, i v okolním prostředí.

Ověření substrátu

Jako substrát se použije kultura buněk Vero, předem odzkoušená pomocí inokula, které neobsahuje více než 100 jednotek vytvářejících kolonie kmene rostoucího dobře v tekuté nebo pevné půdě a dokáže se schopnost metody prokázat případnou kontaminaci mykoplazmaty, např. vhodnými kmeny Mycoplasma hyorhinis a Mycoplasma orale. Mohou se použít různé buněčné substráty, např. produkční buněčná linie, jestliže se prokázalo, že poskytne přinejmenším stejnou citlivost pro důkaz možné kontaminace mykoplazmaty.

Zkušební metoda

Nejméně 1 ml zkoušeného přípravku se použije k dvojnásobnému naočkování, jak je popsáno v odstavci Postup zkoušky, na kulturu indikátorových buněk představující plochu nejméně 25 cm² souvislé buněčné kultury.

Do zkoušky se zařadí negativní (neinfikovaná) kontrola a dvě pozitivní kontroly mykoplazmat, jako např. Mycoplasma hyorhinis a Mycoplasma orale. Pro pozitivní kontrolu sé použije k očkování inokulum, které obsahuje nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie.

Jestliže pro virové suspenze je interpretace výsledků ovlivněna zřetelnými cytopatickými efekty, může se virus neutralizovat specifickým antisérem, které nemá inhibiční účinek na mykoplazmata, nebo se použije substrát buněčné kultury, který neumožní pomnožení viru. K průkazu nepřítomnosti inhibičního účinku v séru se provedou kontrolní zkoušky v přítomnosti a v nepřítomnosti antiséra.

Postup zkoušky

1. Připraví se kultura v pravidelné hustotě (2.10⁴ až 2.10⁵ buněk v mililitru, 4.10³ až 2,5.10⁴ buněk/cm²) a inkubuje se při 36 °C ± 1 °C nejméně dva dny. Naočkuje se zkoušený přípravek a inkubuje nejméně dva dny. Provede se nejméně jedna subkultivace. Poslední subkultura se pěstuje na krycím sklíčku ve vhodné nádobě nebo na nějakém jiném povrchu vhodném pro postup zkoušky. U poslední subkultury se nenechá dojít ke splývání nárůstu, protože by to mohlo inhibovat barvení a narušit zobrazení mykoplazmat.
2. Odstraní se živná půda.
3. Nárůst se promyje tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 7,4 a potom směsí stejných objemových dílů tohoto tlumivého roztoku a vhodného fixačního roztoku a nakonec fixačním roztokem. Pokud se pro barvení používá bisbenzimid R, pak je vhodným fixačním roztokem čerstvě připravená směs objemových dílů kyseliny octové ledové R a methanolu R (1 + 3).
4. Přidá se fixační roztok a nechá se 10 min stát.
5. Fixační roztok se odstraní.
6. Jestliže se nárůst bude barvit později, úplně se vysuší. Zvláštni péči potřebuje barvení na sklíčku po vysušení, protože mohou vznikat artefakty.
7. Jestliže se nárůst barví ihned, vymyje se fixační roztok dvakrát sterilní vodou, která se odstraní.
8. Přidá se bisbenzimid pracovní roztok R nebo nějaký jiný vhodný roztok barvící DNK a nechá se stát 10 min.
9. Odstraní se barvivo a nárůst se promyje vodou.
10. Každé podložní sklíčko, je-li to vhodné, se pokryje kapkou směsi stejných objemových dílů glycerolu R a tlumivého roztoku fosforečnan-citronanového o pH 5,5, přebytečná kapalina se odsaje z rohů podložního sklíčka.
11. Vyšetří se epifluorescencí (330 nm/380 nm excitační filtr, LP 440 nm clona) při 100 až 400 násobném zvětšení nebo větším.
12. Mikroskopický vzhled zkoušené kultury se porovná s negativní a pozitivní kontrolou a vyšetri na mimojadernou fluorescenci. Mykoplazmata se jeví jako body nebo vlákna v cytoplasmě a občas i v mezibuněčném prostoru.