2.6.8 Zkouška na pyrogenní látky

Podstata zkoušky. Pyrogenní látky obsažené ve sterilním injekčním roztoku vyvolají u králika po nitrožilním podání vzestup jeho rektální teploty.

Výběr zvířat. Ke zkoušce se použijí zdraví dospělí králici3~ o hmotnosti nejméně 1,5 lcg. Zvířata jsou chována v klidném prostřeďí v individuálních klecích, krmena standardní vyváženou dietou bez obsahu antibiotik a jejich hmotnost nevykazuje během týdne před zkouškou žádný úbytek. Teplota chovné místnosti je stálá a neliší se o více než 3 °C od teploý zkušební místnosti. U všech králíků, používaných k těmto zkouškám, se vedou záznamy o jejich hmotnosti, podaných přípravcích a teplotních křivkách. Po zkoušce s nepyrogenním výsledkem se může lcrálilc vzít do nové zkoušky nejdříve za 3 dny, po zkoušce s pyrogenním přípravkem se tento interval prodlužuje na 3 týdny. s~ Doporučuje se používat samců vhodného jednotného plemene o hmotnosti 2,0 kg až 3,8 kg.

Přístrojové vybavení. Pohyblivost králíka při zkoušce se omezuje vhodným zařízením, které fixuje netraumatizujícím způsobem pouze šíji zvířete a dovolí mu zaujmout normální uvolněnou pozici v sedě. K měření tělesné teploty se použijí rektální teploměry nebo elektrické termometry, které udávají teplotu s přesností 0,1 °C. Po lehkém potření nedráždivou vazelínou jsou zavedeny do lconečnílcu za vnitřní sfinl~ter, tj. přibližně do hloubky 5 cm. Tato hloubka zavedení teploměru musí být u každého králíka během celé zkoušky konstantní.

Nádoby, injekční střílcačlcy a jehly, které přicházejí do styku se zkoušeným roztokem, se pečlivě vymyjí vodou pro injekci a sterilizují v horkovzdušném sterilizátoru 30 min při 250 °C nebo 1 h při 200 °C.

Předběžné otestování králíků. U každého králíka, vybraného pro zkoušku na pyrogen, je třeba otestovat jeho citlivost na nepyrogenní roztok chloridu sodného (9 g/l), zahřátý na 38,5 °C a podaný nitrožilně v dávce 10 mUkg tělesné hmotnosti. Rektální teplota měřená průběžně od 90 min před injekcí do 3 h po injekci nevykazuje změnu vyšší než 0,6 °C, jinak se zvíře nepoužije k vlastní zkoušce. Tento test citlivosti se též provede u všech králíků, kteří mají být po zkoušce s pyrogenním výsledkem znovu vzati do pokusů.

Provedení zkoušky. Zkouška se provádí v oddělené nerušené místnosti se stálou teplotou kolem 20 °C. Ke zkoušce se použijí tři králíci, kterým je večer předtím odebrána potrava. Po upoutání do fi~xačního zařízení a zavedení rektálních termometrů se u každého zvířete 90 min sleduje tělesná teplota v 30min intervalech. Za "výchozí teplotu" králíka je považován průměr ze dvou odečtů, naměřených v posledních 40 min před podáním zkoušeného roztoku. "Maximální teplotou" se rozumí nejvyšší teplota naměřená v 30min intervalech v průběhu 3 h po podání zkoušeného roztoku. Reakce králíka je vyjádřena rozdílem mezi jeho výchozí a maximální naměřenou teplotou. Jestliže je tento rozdíl negativní, je výsledekpočítán jako nulová odpověď. Ze zkoušky se vyřadí králík, u kterého se při stanovení "výchozí teploty" liší naměřené dvě hodnoý o více než 0,2 °C nebo "výchozí teplota" je vyšší než 39,8 °C nebo nižší než 38,0 °C. U jednotlivých zvířat ve skupině se jejich "výchozí teploty" mezi sebou neliší o více než 1 °C.

Zkoušený roztok, zahřátý na teplotu asi 38,5 °C, se pomalu vstříkne do marginální ušní žíly králika s dobou podání nejvýše 4 min, není-li v příslušném článku uvedeno jinak. Zkoušená látka se může rozpustit nebo zředit nepyrogenním roztokem chloridu sodného (9 g/l) nebo jiným přede psaným ředidlem. Množství látky pro provedení zkoušky se liší podle zkoušeného přípravku a j e předepsáno v příslušném článku. Objem vstřikovaného roztoku má být nejméně 0,5 ml/kg a nejvýše 10 ml/lcg tělesné hmotnosti.

Zhodnocení výsledků. Výsledek zkoušky se posoudí na základě naměřených vzestupů rel~tální teploty u použité skupiny králíků podle tabulky 2.6.8-1.

Jestliže součet reakcí (tj. vzestupů rektální teploty u jednotlivých králíků ve skupině) je vyšší než hodnoty uvedené v druhé kolonce, ale menší než limity uvedené ve třetí kolonce, zkouškas e opakuje na další trojici králíků až do celkového a konečného počtu dvanácti zvířat. Králici, u nichž vzestup rektální teploty ve zkoušce na pyrogen přestoupí 1,2 °C, se trvale vyřadí.

Tab. 2.6.8-1 Počet králíků Přípravek vyhovuje, není-li sou- Přípravek nevyhovuje, je-li sou čet reakcí v šší než čet reakcí šší než 3 1,15 °C 2,65 °C 6 2,80 °C 4,30 °C 9 4,45 °C 5,95 °C 12 6,60 °C 6,60 °C