2.7.10 Stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru VII

1999

Podstata zkoušky. Při stanovení účinnosti koagulačního faktoru VII se využívá jeho biologické aktivity v komplexu faktor VIIa-tkáňový faktor při aktivaci faktoru X za přítomnosti vápenatých iontů a fosfolipidů. Účinnost přípravku faktoru VII se stanoví porovnáním množství přípravku potřebného k dosažení určitého stupně tvorby faktoru Xa ve zkoušené směsi obsahující látky účastnící se aktivace faktoru X s množstvím mezinárodního standardu nebo porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je zapotřebí ke stejnému stupni tvorby faktoru Xa.

Mezinárodní jednotka je účinnost faktoru VII obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaná plazma. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Metoda chromogenního stanovení účinnosti se skládá ze dvou fází: z aktivace reakční směsi faktoru X, která obsahuje tkáňový faktor, fosfolipidy a vápenaté ionty a závisí na faktoru VII, a z následného enzymatického rozštěpení chromogenního substrátu faktoru Xa na chromofor, jehož množství se může stanovit spektrofotometricky.

Za vhodných podmínek stanovení účinnosti je lineární závislost mezi stupněm tvorby faktoru Xa a koncentrací faktoru VII. Stanovení účinnosti je shrnuto ve schématu na obrázku 2.7.10-1. V obou fázích se používají zkoumadla, která lze získat komerčně z různých zdrojů. Ačkoliv se složení jednotlivých zkoumadel může lišit, existují jejich nezbytné vlastnosti, které jsou dále podrobně popsány.

Fáze 1:

Fáze 2:

Obr. 2.7.10-i. Schematické znázornění stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru VII

Zkoumadla

Názvem zkoumadla koagulačního faktoru se označuje skupina přečištěných bílkovin lidského či hovězího původu. Zahrnuje faktor X a tromboplastinový tkáňový faktor/fosfolipid jako aktivátor faktoru VII. Tyto bílkoviny jsou částečně přečištěny a neobsahují nečistoty, které zasahují do aktivace faktoru VII nebo faktoru X. Faktor X je přítomen v množství, které během první fáze stanovení dává konečnou koncentraci 10 nmol/l až 350 nmol/l, přednostně 14 nmol/l až 70 nmol/l. Jako tkáňový faktor/fosfolipid se mohou používat tromboplastin přírodního původu (hovězí nebo králičí mozek) nebo syntetické přípravky. Tromboplastin vhodný ke stanovení tromboplastinového času se ředí 1 : 5 až 1 : 50 tlumivým roztokem tak, aby konečná koncentrace vápenatých iontů byla 15 mmol/l až 25 mmol/l. Konečná tvorba faktoru Xa probíhá v roztoku, který obsahuje lidský nebo hovězí albumin v takové koncentraci, že nedochází k adsorpčním ztrátám, a jehož pH je vhodně upraveno na 7,3 až 8,0. V konečné inkubační směsi je faktor VII jedinou složkou limitující stupeň tvorby faktoru Xa a žádná reakční složka nemá mít vlastní schopnost tvořit faktor Xa.

Ve druhé fázi se určí množství vzniklého faktoru Xa za použití chromogenního substrátu, který je specifický pro faktor Xa. Obvykle je tvořen krátkým peptidem o třech až pěti aminových kyselinách vázaným na chromoforovou skupinu. Při odštěpení této skupiny od peptidového substrátu se její absorpční maximum posune k vlnové délce umožňující spektrofotometrické stanovení množství. Substrát se obvykle rozpustí ve vodě R a používá se ve výsledné koncentraci 0,2 mmol/l až 2 mmol/l. Substrát může také obsahovat vhodné inhibitory k zastavení další tvorby faktoru Xa (přidání edetanu).

Postup stanovení účinnosti

Celý obsah jedné ampule porovnávacího přípravku a zkoušeného přípravku se rozpustí přidáním vhodného množství vody R; použije se během 1 h. Rozpuštěné přípravky se dále naředí tak, aby vznikly roztoky obsahující 0,5 m.j. až 2,0 m.j. faktoru VII v mililitru.

Připraví se další ředění porovnávacího a zkoušeného přípravku za použití izotonického tlumivého roztoku nevázajícího vápník, která obsahují 1 % hovězího nebo lidského albuminu a přednostně mají pH 7,3 až 8,0. Připraví se nejméně tři oddělená nezávislá ředění pro každý pří pravek, nejlépe ve dvojici. Ředění se připraví tak, aby konečná koncentrace faktoru VII byla nižší než 0,005 m.j. v mililitru.

Připraví se kontrolní roztok, který obsahuje všechny složky kromě faktoru VII.

Všechna ředěni se připravují ve zkumavkách z plastů a použjí se během 1 h.

1. fáze. Ředění porovnávacího přípravku faktoru VII a zkoušeného přípravku se smíchají s vhodným objemem předehřátého zkoumadla koagulačního faktoru nebo s kombinací jeho jednotlivých složek a směs se inkubuje ve zkumavkách z plastů nebo na mikrotitračních deskách při 37 °C. Koncentrace různých složek během tvorby faktoru Xa odpovídá specifikaci uvedené v popisu zkoumadla.

Aktivace faktoru X se nechá probíhat po vhodnou dobu. Obvykle se reakce ukončí předtím, než koncentrace faktoru Xa dosáhne své maximální hladiny, aby se docílila uspokojivá lineární závislost mezi dávkou a odpovědí. Doba aktivace se volí tak;, tak, aby tvorba faktoru Xa byla lineárně závislá na čase. Vhodné doby aktivace obvykle kolísají mezi 2 min a 5 min, ale jsou přípustné odchylky, pokud je dosaženo přijatelné linearity ve vztahu mezi dávkou a odpovědí.

2. fáze. Aktivace se ukončí přidáním předehřátého zkoumadla s obsahem chromogenního substrátu. Provádí se hodnocení stupně štěpení substrátu, které musí být lineární s koncentrací vzniklého faktoru Xa, měřením změny absorbance při vhodné vlnové délce za použití spektrofotometru. Použije se buď průběžné sledování absorbance, které umožňuje vypočítat počáteční stupeň štěpení substrátu, nebo se po vhodné době ukončí hydrolýza snížením pH po přidání vhodné látky, jako je kyselina octová (500 g/l C²H⁴0²) nebo roztok citronanu (1mol/l) na pH 3. Doba hydrolýzy se nastaví tak, aby se dosáhlo lineární závislosti tvorby chromoforu na čase. Vhodné trvání hydrolýzy obvykle kolísá mezi 3 min a 15 min, ale jsou přípustné odchylky, pokud se dosáhne lepší lineární závislosti mezi dávkou a odpovědí.

Zkontroluje se validita stanovení a vypočítá se účinnost zkoušeného přípravku obvyklými statistickými metodami (např. 5.3. Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).