2.7.11 Stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru IX

1998

Podstata zkoušky. Učinnost zkoušeného přípravku se stanoví porovnáním množství přípravku potřebného ke zkrácení srážecího času zkušební směsi obsahující jiné látky než faktor IX, jež se podílejí na srážení krve, s množstvím porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je zapotřebí k vyvolání stejného účinku.

Mezinárodní jednotka je účinnost deklarovaného množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaný koncentrát lidského koagulačního faktoru IX. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Postup stanovení. Zkoušený přípravek a porovnávací přípravek se odděleně rozpustí podle návodu uvedeného v označení na obalu a ihned se použijí. Pokud přípravek obsahuje heparin, stanoví se jeho množství (2.7.12) a heparin se neutralizuje přidáním protaminiumsulfatu R (l0 µg prota miniumsulfatu neutralizuje 1 m.j. heparinu). Zkoušený přípravek a porovnávací přípravek se zředí dostatečným množstvím tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 tak, aby se získaly roztoky obsahující 0,5 m.j. až 2,0 m.j. v mililitru. Směsí objemových dílů roztoku citronanu sodného R (38 g/l) a tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 (1 + 5) se připraví řada dvojnásobných ředění v rozmezí 1 : 10 až 1 : 80. Tato ředění je třeba připravit přesně a ihned je použít.

Použijí se např. inkubační zkumavky, které se ponechají ve vodní lázni při 37 °C. Do každé z nich se dá 0,1 ml plazmy substrátu RS2 a 0,1 ml příslušného ředění zkoušeného nebo porovnávacího přípravku. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml vhodného ředění zkoumadla cefalinového R nebo krevních destiček náhrady R a 0,1 ml suspenze 0,5 g kaolinu lehkého R ve 100 ml roztoku chloridu solného R (9 g/l). Pak se obsah zkumavek inkubuje 10 min za stálého protřepávání. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml chloridu vápenatého R (7,4 g/l).

Pomocí stopek se změří srážení čas, tj. interval mezi přidáním chloridu vápenatého a prvními známkami tvorby fibrinu, což je možno určit vizuálně nebo vhodným přístrojem. K výpočtu účinnosti se použijí obvyklé statištické metody (např. 5.3 Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).

Aby se zajistilo, že plazma substrát RS2 neobsahuje zjistitelnou kontaminaci faktorem IX, provede se slepá zkouška, v níž se místo zkoušeného přípravku použije odpovídající množství směsi objemových dílů roztoku citronanu sodného R (38 g/l) a tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 R (1 + 5). Zkoušku lze hodnotit, jestliže srážecí čas slepé zkoušky je v rozmezí 100 s až 200 s.