2.7.12 Stanovení účinnosti heparinu v koncentrátech koagulačních faktorů
1998
Podstata zkoušky. Měří se absorbance při 405 nm roztoku zkoušeného vzorku a roztoku referenčního přípravku heparinu po inkubaci s definovaným nadbytkem trombinu a chromogenního substrátu specifického pro trombin. Nárůst absorbance (v závislosti na množství uvolněného p-nitroanilinu) při 405 nm je nepřímo úměrný množství heparinu ve vzorku.
Zkoušené roztoky. Přípravek se rozpustí předepsaným způsobem a naředí se vhodným tlumivým roztokem (např. roztok chloridu sodného R (7 g/l) a citronanu sodného R (6 g/l) o pH 7,3) na koncentraci asi 0,25 m.j. heparinu v mililitru. Připraví se řada ředění (až do 1 : 32) za použití vhodného tlumivého roztoku (např. roztok trometamolu R (6 g/l), kyseliny edetové R (2,2 g/l), chloridu sodného R (11,3 g/l) o pH 8,4). Naředěné roztoky se nechají stát 30 min.
Porovnávací roztoky. Referenční přípravek heparinu se naředí vhodným tlumivým roztokem (např. roztok trometamolu R (6 g/l), kyseliny edetové R (2,2 g/l), chloridu sodného R (11,3 g/l) o pH 8,4) na koncentraci asi 0,25 m.j. heparinu v mililitru a připraví se řada ředění (až do 1 : 32).
Postup stanovení. Do řady zkumavek z plastu se napipetuje po 200 µl zkoušeného roztoku nebo porovnávacího roztoku nebo kontrolního roztoku (tlumivý roztok použitý k ředění) a po 200 pl roztoku antitrombinu III R (3 m.j./ml). Směs se nechá stát 30 min a přidá se po 200 pl roztoku trornbinu hovězího R (20 m.j./ml). Řádně se promíchá pomocí vibrační míchačky a nechá se stát 90 s při 37 °C.
Připraví se roztok chromogenního substrátu specifického pro trombin v koncentraci odpovídající nejméně dvojnásobku hodnoty Km, (Michaelisovy konstanty).
Substrátový roztok se ohřeje na 37 °C a přidá se po 200 pl do každé zkumavky, která obsahuje zkoušený roztok, porovnávací roztok nebo kontrolní roztok. Vše se řádně promíchá pomocí vibrační míchačky. Inkubuje se 90 s při 37 °C a reakce se zastaví přidáním po 200 µl roztoku kyseliny octové R (500 g/l C2H402) a změří se absorbance při 405 nm.
Obsah heparinu ve zkoušeném přípravku se vypočítá za použití obvyklých statistických metod (např. 5.3. Statistické analýry výsledků biologických zkoušek).