2.7.13   Stanovení účinnosti lidského imunoglobulinu anti-D

2001

Účinnost se stanoví porovnáním množství, které je zapotřebí k aglutinaci D-pozitivních červených krvinek, s množstvím referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je zapotřebí k dosažení stejného účinku.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního referenčního přípravku. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravofiická organizace.

Použije se směs D-pozitivních červených krvinek, ne starších než 7 dní, vhodně uchovávaných a získaných od nejméně čtyř dárců krve s krevní skupinou O R₁R₁. Ke vhodnému objemu krvinek třikrát propraných roztokem chloridu sodného R (9 g/l) se přidá stejný objem bromelinů RS, nechá se 10 min stát při 37 °C, odstředí se, supernatantní tekutina se odstraní a krvinky se třikrát promyjí roztokem chloridu sodného R (9 g/l). 20 objemových dílů červených krvinek se suspenduje ve směsi 15 objemových dílů inertního séra, 20 objemových dílů roztoku albuminu hovězího R (300 g/l) a 45 objemových dílů roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Vzniklá suspenze se vloží do vody s ledem a stále se promíchává.

Použitím automatického kalibrovaného dilutoru se připraví vhodná ředění zkoušeného a referenčního přípravku. K ředění se použije roztok albuminu hovězího R (5 g/l) v roztoku chloridu sodného R (9 g/l).

Použije se vhodný přístroj pro automatickou kontinuální analýzu: teplota trubice, kromě inkubačních spirál, se udržuje na 15 °C. Do trubice přístroje se vpraví suspenze červených krvinek rychlostí 0,1 ml/min a roztok methylcelulosy 450 R (3 g/l) rychlostí 0,05 ml/min. Ředění zkoušeného a referenčního přípravku se provádějí rychlostí 0,1 ml/min po dobu 2 min a po každém z nich se provede opláchnutí ředícím roztokem rychlostí 0,1 ml/min po dobu 4 min před zavedením dalšího ředění.

Vzduch se přivádí rychlostí 0,6 ml/min. Inkubuje se 18 min při 37 °C a pak se shluk rozptýlí přivedením roztoku chloridu sodného R (9 g/l), obsahujícího vhodné smáčedlo (např. polysorbát 20 R v konečné koncentraci 0,2 g/l, rychlostí 1,6 ml/min, aby se zabránilo porušení bublinové struktury. Aglutináty se nechají sedimentovat a dvakrát se promyjí, nejprve při 0,4 ml/min a poté 0,6 ml/min. Neaglutinované červené krvinky se lyzují roztokem, který obsahuje oktoxinol 10 R (5 g/l), hexakyanoželezitan draselný R (0,2 g/l), hydrogenuhličitan sodný R (1 g/l) a kyanid draselný R (0,05 g/l), přiváděným rychlostí 2,5 ml/min. Ke konverzi hemoglobinu se zavede desetiminutová prodlévací spirála. Průběžně se zaznamenává absorbance (2.2.25) hemolyzátu při vlnové délce 540 nm až 550 nm. Stanoví se rozmezí koncentrací protilátky, v němž je mezi koncentrací a výslednou změnou absorbance (?A) lineární závislost. Z výsledků se sestrojí standardní křivka a její lineární část se použije ke stanovení účinnosti zkoušeného přípravku.

Účinnost zkoušeného přípravku se v mezinárodních jednotkách na mililitr vypočítá ze vzorce:

v němž značí:
a - účinnost ředění D referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách na mililitr,
d - faktor ředění zkoušeného přípravku, u kterého se zjistila daná hodnota ?A,
D - faktor ředění referenčního přípravku, u kterého se zjistila stejná hodnota ?A.