2.7.2 Mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik.
R99
Účinnost antibiotika se stanoví porovnáním inhibice růstu citlivých mila~oorganismů vyvolané známými koncentracemi zkoušeného antibiotika a referenční látky.
Referenční látky použité ke stanovení jsou ty, jejichž účinnost byla přesně stanovena v poměru k odpovídajícímu mezinárodnímu standardu nebo mezinárodnímu referenčnímu přípravku.
Plán stanovení je takový, aby dovolil ověřit validitu matematického modelu, na němž je založeno porovnání účinnosti. Je-li vybrán model rovnoběžných přímek, dvě logaritmické přímky dávky a odpovědi (nebo transformované odpovědi) zkoušeného pripravku a referenčního příprav ku jsou rovnoběžné a jsou lineární v intervalu dávek použitých k výpočtu. Tyto podmínky se validují pro danou hladinu pravděpodobnosti, obvykle P = 0,05. Jiné matematické modely, jako model např. regresního poměru, mohou být též použity, je-li prokázána validita zkoušky.
Pokud není v článku uvedeno jinak, je interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovení nejméně 95 a nejvýše 105 % stanovené účinnosti.
Stanovení se provádí metodou A nebo metodou B.
Živná půda vhodná pro stanovení se rozehřeje a při vhodné teplotě, např. 48 °C až 50 °C pro vegetativní formy, se naočkuje suspenzí mikroorganismů citlivých na zkoušené antibiotikum v takovém množství, které vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny o průměru přiměřeném kon centraci zkoušeného antibiotika. Naočkovaná půda se ihned vylije do Petriho misek nebo velkých pravoúhlých misek (ploten) v takovém množství, aby se vytvořila jednolitá vrstva silná 2 mm až 5 mm. Živná půda může být též vylita ve dvou vrstvách, z nichž jenom vrchní je naočkována. Takto připravené misky se uchovávají tak, aby před použitím nedošlo k viditelnému růstu mikroorganismů nebo k jejich usmrcení a aby povrch půd byl v čase použití suchý.
Pro přípravu roztoků stejných účinností a známých koncentrací zkoušeného antibiotika a referenční látky se použijí rozpouštědla a tlumivé roztoky uvedené v tabulce 2.7.2-1. Roztoky se nanesou bud' na povrch půdy, např. do sterilních cylindříků z porcelánu, z nerezavějící oceli, pří padně z jiných vhodných materiálů, nebo do otvorů vyříznutých v živné půdě. Do každého cylindříku nebo otvoru se přidá stejný objem roztoků. Lze též použít sterilní disky z absorbujícího papíru vhodné kvality, které se před položením na půdu napustí roztoky referenční látky nebo zkoušeného antibiotika.
K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři rozdílné dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušeného antibiotika s předpokládanou stejnou účinností jako dávky referenční látky. Doporučuje se používat geometrickou řadu dávek. Při běžných stanoveních, u nichž je pro kázán lineární průběh systému na přiměřeném počtu třídávkových stanovení, a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita, může postačovat i dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných případech se však použije metoda tridávková, jak je předepsáno výše.
Do každé Petriho misky nebo pravoúhlé misky se nanesou roztoky podle statisticky vhodného plánu. V případě malých misek, které nepojmou více než šest roztoků, se doporučuje měnit umístění roztoku zkoušeného antibiotika a referenční látky, aby se zabránilo interakcím koncentrovanějších roztoků.
Metody stanoveni účinnosti 3485
Inkubuje se při vhodné teplotě asi 18 h. Doba předinkubační difuze, obvykle 1 h až 4 h, při pokojové teplotě nebo 4 °C, jak je vhodné, se může použít k potlačení účinku časových rozdílů mezi aplikací roztoků a tak zlepšit regresi.
Změří se průměry kruhových inhibičních zón s přesností nejméně 0,1 mm nebo jejich plochy s přesností. Pomocí vhodných statistických metod se vypočítá účinnost zkoušeného antibiotika.
V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik inlubičních zón, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti se může opakovat a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.
Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda
Antibioti- Referenční Rozpouště- Tlumivý Mikroorga- Půda Inkubační
kum látka dlo roztok (pH) nismus a konečné teplota (°C)
k přípravě pH (t 0,1)
základního
roztoku
Amphoteri- Amphoteri- Dimethyl- pH 10,5 Saccharo- F - pH 6,1 35 až 37
cinum B cinum B formamid R (0,2 mol/l) mycescere
CRL visiae
IP I432.83
ATCC 9763
CCM 8191
CNCTC
S 1165
Bacitraci- Bacitraci- kyselina pH 7,0 Micrococ- A - pH 7,0 35 až 39
num zinci- num zincž- chlorovodí- (0,05 mol/l) cus flavus
cum cum CRL ková 0,01 NCTC 7743
mol/l VS CIP 53.160
AT
CC 10240
CCM 732
CNCTC M
8/58
Bleomycini Bleomycini voda R pH 6,8 Mycobacte- G-pH 7,0 35 až 37
sulfas sulfas CRL (0,1 mol/l) rium smeg
matis
ATCC 607
CCM 4622
CNCTC My
23/64
Colistini Colistini Bordetella B -pH 7,3 35 až 39
sulfas sulfas CRL bronchisep
tica
NCTC 8344
CIP 53.157
ATCC 4617
3486 Zkušební metody
CCM 4416
voda R pH 6,0 CNCTC Brb
Colistimet- (0,05 mol/l) 5/63 B - pH 7,3 35 až 39
Colistimet- hatum nat- Escherichia
hatum ricurn CRL coli
natricum NCIB 8879
CIP 54.127
ATCC
10536
CCM 3988
CNCTC Ec
326/71
Dihydro- Dihydro- voda R pH 8,0 Bacillus A - pH 7,9 30 až 37
streptomy- streptomy- (0,05 mol/l) subtilis
cini cini sulfas NCTC 8236
sulfas CRL CIP 1.83
CCM 2217
CNCTC Bs
17/65 A - pH 7,9 30 až 37
Bacillus
subtilis
NCTC
10400
CIP 52.62
ATCC 6633
CCM 1999
CNCTC Bs
8/58
Erythromy- methanol R Bacillus A - pH 7,9 30 až 37
cini estolas viz pumilus
Erythromy- články NCTC 8241
cťnum CRL CIP 76.18
Erythromy- CCM 2218
cini ethylsu- methanol R pH 8,0 CNCTC
ccinas (0,05 mol/l) Bac 2/65
Bacillus A - pH 7,9 30 až 37
subtilis
Erythromy- NCTC
cini stearas 10400
CIP 52.62
ATCC 6633
CCM 1999
CNCTC Bs
8158
Framycetini Framycetini voda R pH 8,0 Bacillus E - pH 7,9 30 až 37
sulfas sulfas CRL (0,05 mol/l} subtilis
Metody stanoveni účinnosti 3487
NCTC
10400
CIP 52.62
ATCC 6633
CCM 1999
CNCTC Bs
8/58 E - pH 7,9 30 až 37
Bacillus
pumilus
NCTC 8241
CIP 76.18
CCM 2218
CNCTC
Bac 2/65
Gentamicini Gentamicini voda R pH 8,0 Bacillus A - pH 7,9 35 až 39
sulfas sulfas CRL (0,05 mol/l) pumilus
NCTC 8241
CIP 76.18
CCM 2218
CNCTC
Bac 2/65
Staphylo- A - pH 7,9 35 až 39
coccus epi
dermidis
NCIB 8853
CIP 68.21
ATCC
12228
CCM 4418
CNCTC M
12/63
Kanamycini Bacillus A - pH 7,9 30 až 37
monosulfas subtilis
Kanamycini voda R pH 8,0 NCTC
monosulfas (0,05 mol/l) 10400
CRL CIP 52.62
ATCC 6633
Kanamycini CCM 1999 A - pH 7,9 35 až 39
sulfas CNCTC Bs
acidus 8/58
Staphylo
coccus
aureus
NCTC 7447
CIP 53.156
ATCC
6538P
3488 Zkušební metody
CCM 2022
CNCTC
Mau 28/58
Neomycini Neomycini voda R pH 8,0 Bacillus E - pH 7,9 30 až 37
sulfas sulfas CRL (0,05 mol/l) pumilus
NCTC 8241
CIP 76.18
CCM 2218
CNCTC E - pH 7,9 30 až 37
Bac 2165
Bacillus
subtilis
NCTC
10400
CIP 52.62
ATCC 6633
CCM 1999
CNCTC Bs
8/58
Netilmicini Netilmicini voda R pH 8 ± 0,1 Staphylo- A -pH 7,9 32 až 35
sulfas sulfas CRL coccus
aureus
CiP 53.156
ATCC
6538P
CCM 2022
. CNCTC
Mau
28/58
Nystatinum Nystatinum dimethyl- pH 6,0 Candida F - pH 6,0 30 až 37
CRL formamid R (0,05 mol/l) tropicalis
obsahující CIP 1433
5 % (VlV) 83
dimethyl- NCYC 1393
formamidu CCM8223
R Saccharo
myces cere
visiae 30 až 32
NCYC 87
' CIP 1432.83
ATCC 9763
CCM 8191
CNCTC
51/65
Polymyxini Polymyxini voda R pH 6,0 Bordetella B - pH 7,3 35 až 39
B sulfas B sz~lfas (0,05 mol/l} bronchisep
Metody stanoveni účinnosti 3489
CRL tica
NCTC 8344
CIP 53.157
ATCC 4617
CCM 4416
CNCTC Brb
5/63
Rifamyci- Rifamyci- methanol R pH 7,0 Micrococ- A - pH 6,6 35 až 39
num natri- num natri- (0,05 mol/l) cus flavus
cum cum CRL NCTC 8340
CIP 53.45
ATCC 9341
CCM 552
CNCTC Sar
5/58
Spiramyci- Spiramyci- methanol R pH 8,0 Bacillus A - pH 7,9 30 až 32
num num CRL (0,05 mol/l) subtilis
NCTC
10400
CIP 52.62
ATCC 6633
CCM 1999
CNCTC Bs
8/58
Streptomy- Streptomy- voda R pH 8,0 Bacillus A - pH 7,9 30 až 37
cini sulfas cini sulfas (0,05 mol/l) subtilis
CRL NCTC 8236
CIP 1.83
CCM 2217
CNCTC Bs
17/65 A - pH 7,9 30 až 37
Bacillus
subtilis
NCTC
10400
CIP 52.62
ATCC 6633
CCM 1999
CNCTC Bs
8/58
Tobramyci- Tobramyci- voda R pH 8,0 Bacillus A - pH 7,9 30 až 37
num num CRL (0,05 mol/l) subtilis
NCTC
10400
CIP 52.62
ATCC 6633
3490 Zkušební metody
CCM 1999
CNCTC Bs
8/58
Tylosinum Tylosinum roztok směs obje- Micrococ- A - pH 8,0 32 až 35
a.u.v. CRL methanolu R mových dílů cus jlavus
(2,5 % methanolu R NCTC 8340
(Y/i~)) a tlumivého CIP 53.45
Tylosini v tlumivém roztoku ATCC 9341
tartras a.u.v. roztoku fosforečna- CCM 552
fosforečna- nového o pH CNCTC Sar
novém o pH 8,0 5/58
7,0 (0,1 mol/l)
(0,1 mol/l) (40 + 60)
Vancomyci- Yancomyci- voda R pH 8,0 Bacillus A - pH 8,0 37 až 39
ni hydro- ni hydro- subtilis
chloridum chloridum NCTC
CRL 10400
CIP 52.62
ATCC 6633
CCM 1999
CNCTC Bs
8/58
B. Turbidimetrická metoda
Vhodná živná půda se naočkuje suspenzí vybraného mikroorganismu, ktery" je citlivý na zkoušené antibiotikum tak, aby se v podmínkách zkoušky docílilo vhodně rozsáhlého potlačení růstu mikrobiální kultury. Použije se známé množství suspenze vybrané tak, aby byl asi po čtyrYhodinové inkubaci dobře měřitelný zákal.
Naočkovaná půda se použije ihned po naočkování.
Pro přípravu roztoků referenční látky a roztoků zkoušeného antibiotika ve známých koncentracích, u nichž se předpokládá stejná účinnost, se použije rozpouštědlo a tlumivý roztok uvedený v tabulce 2.7.2-2. K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři dávky referenční látky a tři dávky zkoušeného antibiotika s předpokládanou stejnou účinností jako dávky referenční látky. Doporučuje se použít geometrickou řadu dávek. K dosažení linearity je někdy nutné vybrat z většího počtu tři následující dávky za použití odpovídajících dávek referenční látky a zkoušeného antibiotika.
Použijí se stejné zkumavky. Do každé z nich se převede stejný objem jednoho z roztoků a stejný objem naočkované živné půdy (např. 1 ml roztoku a 9 ml živné půdy).
Zároveň se připraví dvě kontrolní zkumavky bez antibiotika s naočkovanou živnou půdou a do jedné se ihned přidá 0,5 ml formaldehydu R. Tyto zkumavky slouží ke standardizaci optického přístroje použitého k měření růstu.
Zkumavky se umístí bud' náhodně, nebo podle latinského čtverce, nebo náhodného bloku do vodní lázně nebo jiného vhodného přístroje, dovolujícího uvést rychle všechny zkumavky na uve
Metody stanovení účinnosti 3491
denou inkubační teplotu. Uchovávají se při této teplotě 3 h až 4 h a zabezpečí se stejná teplota a stejná doba inkubace.
Po inkubaci se zastaví ve všech zkumavkách růst mikroorganismů pňdáním 0,5 ml formaldehydu R nebo zahřátím a změří se zákal s přesností na tři místa za použití vhodného optického přístroje. Alternativně lze použít jiný postup, ktery" dovoluje měřit zákal každé zkumavky po přesně stejné době inkubace.
Vypočítá se účinnost za pomoci vhodných statistických metod.
Linearita vztahu dávka - odpověď, transformovaná nebo netransformovaná, je často získána pouze ve velmi omezeném intervalu; je to ten interval, který se má použít pro výpočet účinnosti a obsahuje nejméně tři následné dávky dovolující ověřit linearitu. Při běžných stanoveních, u nichž je prokázán lineární průběh systému, pokud byla na přiměřeném počtu třídávkových stanovení a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita, může postačovat dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných případech se však použije třídávková metoda.
V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik zkumavek, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti se může opakovat a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.
Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda
Antibioti- Referenční Rozpouště- Tlumivý Mikroorga- Půda Inkubační
kum látka dlo roztok nismus a konečné teplota
k přípravě (pH) pH (°C)
základního (f 0,1)
roztoku
Colistini Colistini Escherichia C-pH 7,0 35 až 37
sulfas sulfas CRL coli
voda R pH 7;0 NCIB 8666
Colistimet- Colistime- CIP 2.83
hatum natri- tliatum nat- ATCC 9637
cum ricum CRL CCM 2024
Dihydro- Dihydro- voda R pH 8,0 Klebsiella C - pH 7,0 35 až 37
strep- streptomy- pneumoniae
tomycini cini sulfas NCTC 7427
sulfas CRL CIP 53.153
ATCC
10031
CCM 4415
CNCTC Klp
85/69
Erythromy- Erythromy- methanol R Klebsiella D - pH 7,0 35 až 37
cini estolas cin CRL viz články pneumoniae
NCTC 7427
Erythromy- pH 8,0 CIP 53.153
cini ethylsu- ATCC
ccinas 10031
CCM 4415
3492 Zkušební metody
Erythromy- CNCTC Klp
cini stearas 85/69
Staphylo- C - pH 7,0 35 až 37
coccus
aureus
NCTC 7447
CIP 53. i 56
ATCC
6538P
CCM 2022
CNCTC
Mau 28/58
Framycetini Framycetini voda R pH 8,0 Staphylo- C - pH 7,0 35 až 37
sulfas sulfas CRL coccus au
reus
NCTC 7447
CIP 53.156
ATCC
6538P
CCM 2022
CNCTC
Mau 28/58
Gentamicini Gentamicini voda R pH 7,0 Staphylo- C - pH 7,0 35 až 37
sulfas sa~lfas CRL coccus au
reus
NCTC 7447
CIP 53.156
ATCC
6538P
CCM 2022
CNCTC
Mau 28/58
Gramicidi- Gramicidi- methanol R pH 7,0 Streptococ
num nurn CRL K zamezení cus faecalis
ztrát způso- ATCC
bených 10541
adsorpcí CCM 4533
v průběhu CNCTC Str C - pH 7,0 3S až 37
ředění může 6/58
být nutná Staphyloco
prisada ccus aureus
detergentu, ATCC
např. poty- 6538P
sorbátu CCM 2022
80 R CNCTC
(0,1 mg/ml) Mau 28/58
Metody stanoveni účinnosti 3493
Kanamycini Staphylo- C-pH 7,0 35 až 37
monosulfas Kanamycini voda R pH 8,0 coccus
monosulfas aureus
Kanamycini CRL NCTC 7447
sulfas CIP 53.156
acidus ATCC
6538P
CCM 2022
CNCTC
Mau 28158
Neomycini Neomycini voda R pH 8,0 Staphyloco- C - pH 7,0 35 až 37
sulfas sulfas CRL ccus aureus
NCTC 7447
CIP 53.156
ATCC
6538P
CCM 2022
CNCTC
Mau 28/58
Rifamyci- Rifamyci- methanol R pH 7,0 Escherichia C - pH 7,0 35 až 37
num natri- num natri- coli
cum cum CRL NICB 8879
CIP 54.127
ATCC
10536
CCM 3988
CNCTC Ec
326/71
Spiramyci- Spiramyci- methanol R pH 7,0 Staphyloco- C - pH 7,0 35 až 37
num num CRL ccus aureus
NCTC 7447
CIP 53.156
ATCC
6538P
CCM 2022
CNCTC
Mau 28/58
Streptomy- Streptomy- voda R pH 8,0 Klebsiella C - pH 7,0 35 až 37
cini sulfas cini sulfas pneumoniae
CRL NCTC 7427
CIP 53.153
ATCC
10031
CCM 4415
CNCTC Klp
85/69
3494 Zkušební metody
Tobramyci- Tobramyci- voda R pH 7,0 Staphyloco- C - pH 7,0 35 až 37
num numCRL ccus aureus
NCTC 7447
CIP 53.156
ATCC
6538P
CCM 2022
CNCTC
Mau 28/58
Tylosinum Tylosinum roztok met- směs obje- Staphyloco- C - pH 7,0 37
a.u.v. CRL hanolu R mových dílů ccusaureus
(2,5 % methanolu R NCTC 6571
(V/Y)) a tlumivého CIP 53.154
Tylosini v tlumivém roztoku ATCC 9144
tartras a.u.v. roztoku fosforečna- CCM 2107
fosforečna- nového CNCTC
novém o pH 8,0 Mau 76/69
o pH 7,0 (0,1 mol/l)
(0,1 mol/l) (40 + 60)
Vancomýci- Vancomyci- voda R pH 8,0 Staphylo- C - pH 7,0 37 až 39
ni hydro- ni hydro- coccus au
chloridum chlori-dům reus
CRL NCTC 7447
CIP 53.156
ATCC
6538P
CCM 2022
CNCTC
Mau 28/58
Následující část se uvádí pro informaci a jako návod netvori závaznou součást obecné metody.
Doporučené mikroorganismy
Následující text uvádí doporučené mikroorganismy a podmínky jejich použití. Jiné mikroorganismy se mohou použít, pokud mají prokazatelně stejnou citlivost na zkoušené antibiotikum a použijí se ve vhodné živné půdě a ve vhodných podmínkách teploty a pH. Výběr koncentrací roztoků se má provést tak, aby zaručil, že v podmínkách zkoušky existuje lineární vztah mezi logaritmem dávky a odpovědí.
Příprava inokula
Bacillats subtilis a Bacillus pumilus. Suspenze spor mikroorganismu použitého k naočkování se připraví takto:
Mikroorganismy se kultivují 7 dní při 35 °C až 37 °C na vhodné pevné půdě, do které byl přidán síran manganatý R (1 mg/l). Nárůst, ktery" obsahuje zejména spory, se spláchne sterilní vodou R. Suspenze se 30 min zahřívá při 70 °C a potom se zředí na přiměřenou koncentraci spor,
Metody stanovení účinnosti 3495
obvykle 10.106 až 100.106 v ml. Suspenze spor se mohou uchovávat po dlouhou dobu při teplotě nepřevyšující 4 °C.
Alternativně se mohou suspenze spor připravit kultivací mikroorganismů v půdě C při 26 °C po dobu 4 dní až 6 dní. Potom se asepticky přidá dostatek síranu manganatého R do koncentrace 1 mg/l a inkubuje se dalších 48 h. V suspenzi se mikroskopicky zjistí, zda proběhla přiměřená tvorba spor (asi 80 %), a suspenze se odstředí. Sediment se resuspenduje ve sterilní vodě R tak, aby se dosáhla koncentrace spor v ml 10.106 až 100.106, a potom se zahřívá 30 min na 70 °C. Suspenze se uchovává při teplotě nepřevyšující 4 °C.
Bordetella bronchiseptica. Testovací mikroorganismus se kultivuje na půdě B 16 h až 18 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilní vodou R a zředí na vhodný zákal.
Staphylococctts auretts, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Micrococcus flavus, Staphylococcus epidermidis. Připraví se stejně, jak je popsáno v odstavci Bordetella bronchiseptica, ale použije se půda A a naředí se na takový zákal, ktery" při turbidimetrickém stanovení prokazatelně poskytuje uspokojující vztah dávky k odpovědi nebo při difuzním stanovení vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny postačujícího průměru.
Sacharomyces cerevisiae, Candida tropicalis. Testovací mikroorganismus se kultivuje 24 h na půdě F při 30 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilním roztokem chloridu sodného R (9 gn) a zředí se jím na vhodný zákal.
Tlumivé roztoky
Tlumivé roztoky o pH v rozmezí 5,8 až 8,0 se připraví smícháním 50,0 ml dihydrogenfosforečnanu draselného 0,2 mol/l RS s množstvím hydroxidu sodného 0,2 mol/l RS, uvedeným v následující tabulce a doplněním čerstvě připravenou vodou destilovanou R na 200,0 ml.
Tab. 2.7.2-3
pH množství hydroxidu sodného 0,2 mol/l RS
v ml
5,8 3,72
6,0 5,70
6,2 8,60
6,4 ~ 12,60
6,6 17,80
6,8 23,65
7,0 29,63
7,2 35,00
7,4 39,50
7,6 42,80
7,8 45,20
8,0 46,80
Tyto tlumivé roztoky se použijí pro všechny mikrobiologické zkoušky uvedené v tabulce 2.7.2-1 s výjimkou:
1) bleomyciniumsulfatu, pro ktery" se tlumivý roztok o pH 6,8 připraví takto: rozpustí se 6,4 g dihydrogenfosforečnanu draselného R a 18,9 g hydrogenfosforečnanu sodného R ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml.
Strana 4978
Částka 97
3496 Zkušební metody
2) amfotericinu, na ktery" se tlumivý roztok o pH 10,5 (0,2 mol/l) připraví takto: 35,08 g hydrogenfosforečnanu draselného R se rozpustí ve vodě destilované R, přidá se 1,12 g hydroxidu draselného R a zředí se vodou destilovanou R na 1000,0 ml.
Živné půdy
Mohou se použít následující půdy nebo půdy jim
rovnocenné.
Pirda A pepton pankreatický hydrolyzát kaseinu hovězí výtažek
kvasničný výtažek glukosa monohydrát agar
voda
6 g 4 g 1,5 g 3 g 1 g 15 g do 1000 ml
Ptřda B
pankreatický hydrolyzát kaseinu papainový hydrolyzát sóji chlorid sodný
hydrogenfosforečnan draselný glukosa monohydrát
agar polysorbát 80 voda
Polysorbát 80 se přidá k horkému roztoku ostatních před upravením objemu.
17 g 3 g 5 g 2,5 g 2,5 g 15 g 10 g do 1000 ml
složek po jejich rozvaření a bezprostředně
Pirda C pepton hovězí výtažek kvasničný výtažek chlorid sodný glukosa monohydrát hydrogenfosforečnan draselný dihydrogenfosforečnan draselný voda
6 g 1,5 g 3 g 3,5 g 1 g 3,68 g 1,32 g do 1000 ml
Půda D
výtažek ze srdce kvasničný výtažek pepton z kaseinu glukosa monohydrát chlorid sodný hydrogenfosforečnan draselný dihydrogenfosforečnan draselný dusičnan draselný
voda
1,5 g 1,5 g 5,0 g 1 g 3,5 g 3,68 g 1,32 g 2 g do 1000 ml
Metody stanovení účinnosti 3497
Půda E
pepton 5 g
masový výtažek 3 g
hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát 26,9 g
agar 10 g
voda do 1000 ml Hydrogenfosforečnan sodný se přidá jako sterilní roztok po sterilizaci půdy.
Půda F
pepton 9,4 g
kvasničný výtažek 4,7 g
hovězí výtažek 2,4 g
chlorid sodný 30,0 g
glukosa monohydrát 10,0 g
agar 23,5 g
voda do 1000 ml
Paida C
glycerol 10 g
pepton 10 g
masový výtažek 10 g
chlorid sodný 3 g
agar 1 S g voda do 1000 ml pH 7 t 0,1 po sterilizaci