2.7.3 Stanovení účinnosti kortikotropinu.

Podstata zkoušky. Účinnost kortikotropinu je přímo úměrnápolclesu obsahu kyseliny aslcorbové v nadledvinách potkana po hypofyzelctomii. Stanovení se provádí v porovnání s účinkem mezinárodního standardu kortikotropinu nebo referečního přípravku, kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je čištěný a lyofilizovaný prasečí kortilcotropin smíchaný s laktosou.

Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Pro stanovení se použijí laboratorní potkani o hmotnosti 100 g až 200 g, při čemž rozdíl mezi nejlehčím a nejtěžším zvířetem ve skupině nemá být větší než 15 g. Potkani se chovají za standardních podmínek nejméně 7 dní před pokusem. Den před vlastní zkouškou se zvířata zváží a provede se hypofyzektomie.2~ Po operaci se potkani umístí do místnosti se stálou teplotou mezi 24 °C až 27 °C a kromě standarďní diety a vody se jim umožní volný přístup k roztoku, obsahujícímu glukosu R (50 g/l) a chlorid rodný R (1,8 g/l). Není-li předepsáno jinak, referenční přípravek i zkoušený přípravek se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS na koncentraci odpovídající 5 m.j . kortikotropinu v 1 ml. K dalšímu ředění pro odstupňované dávky se použije roztok želatiny R (150 g/l). Roztoky se použijí nejpozději do 4 h po přípravě. Za 18 h až 36 h po hypofyzektomii se potkani znovu zváží a rozdělí do šesti skupin po osmi až deseti zvířatech. Třem skupinám se podává referenční přípravek a třem skupinám zkoušený přípravek ve třech odstupňovaných dávkách. Dávky se volí tak, aby po nejnižší dávce nastalo již hodnotitelné snížení obsahu kyseliny aslcorbové v nadledvinách a po nejvyšší nebylo ještě dosaženo největší snížení. Dávky se přepočtou na tělesnou hmotnost jednotlivého potkana a vstříknou se poďkožně v objemu 0,5 ml/kg. Obvykle jsou vhodné dávky v pořadí: 1,0 m.j., 0,5 m.j. a 0,25 m.j. kortikotropinu na 100 g tělesné hmotnosti. 2) Místo hypofyzektomie je možno u potkanů použít blokádu funkce hypofýzy podáním vhodné látky např. dexamethasonu (viz článek Corticotropinum).

Přesně za tři hodiny po podání lcortikotropinu se každému potkanovi v celkové anestezii vyjmou obě nadledviny, rychle se očistí od cizí tkáně a co nejrychleji se zváží, aby se předešlo ztrátě hmotnosti.

Vloží se do homogenizační zkumavky obsahující 2 ml čerstvě připraveného roztoku kyseliny metafosforečné R (25 g/l). Potkani se usmrtí a provede se kontrola úplnosti hypofyzektomie. Nadledviny se zhomogenizují a obsah zkumavky se zředí stejným roztokem kyseliny metafosforečné R (25 g/l) na 10 ml. Za 30 min stání při pokojové teplotě se homogenát odstřed'uje a 7 ml čiré supernatantní tekutiny se přidá k čerstvě připravené směsi tohoto složení: 7 ml roztoku octanu sodného R (45,3 g/l) upraveného přidáním kyseliny octové R na pH 7,3 ml vody R, 2 ml dichlorfenolindofenolatu sodného RS.

Za 30 s po smíchání se měří kolorimetriclcy absorpce. Použije se filtr s největší transmisí při 470 nm a transmise s rozsahem od 450 nm do 520 nm. Obsah kyseliny askorbové se odečte ze standarďní kalibrační křivky, která se sestrojí z výsledků měření vhodných objemů čerstvě připraveného roztoku kyseliny askorbové R přidaných do roztoku kyseliny metafosforečné R (25 g/l). Obsah kyseliny askorbové se vyj ádří v miligramech na 100 g tkáně nadledvin každého potkana. Vypočtou se průměrné hoďnoý pro potkany ve všech třech dávkových skupinách referenčního přípravku a zkoušeného přípravku a výsledky se vyhodnotí vhodnou statistickou metodou ( 5.3).