2.7.5 Stanovení účinnosti heparinu.

Antilcoagulační účinnost heparinu se stanoví in vitro porovnáním jeho schopnosti zpomalovat za daných podmínek srážení relcalcifilcované citronanové ovčí plazmy se stejnou schopností referenčního přípravku heparinu, kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

Mezinároání jeánotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaná sodná sůl heparinu, připravená z vepřové střevní mukózy. Hoďnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinároďních jeďnotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace. Účinnostsodné soli heparinu BF

Provede se stanovení j ednou z následujících metod pro určení počátku srážení s použitím zkumavek a dalšího, pro zvolenou metodu vhoďného zařízení:

A) přímá vizuální detekce, nejlépe při nepřímém osvětlení proti matnému černému pozadí, b) spektrofotometrický záznam změny optické hustoty při vlnové délce asi 600 nm,

C) vizuální detekce změny tekutosti při ručním přeldápění zkumavek,

D) automatický záznam změny tekutosti při míchání; dbá se, aby se při začáteční fázi srážení co nejvíce předešlo narušení roztoku.

Postup stanovení. Objemy uvedené v dalším textu slouží jako příklady a mohou být přizpůsobeny zvolenému zařízení za předpokladu, že jejich poměry zůstanou zachovány. Sodná sůl heparinu BRP se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby výsledný roztok obsahoval v mililitru přesně známý počet mezinároďních jednotek. Obdobně se připraví roztok zkoušeného přípravku o stejné předpokládané účinnosti. Pomocí roztoku chloridu sodného R (9 g/l) se z obou roztoků připraví geometrické řady ředění tak, aby čas srážení zaznamenaný pro nejnižší koncentraci byl nejméně 1, Snásobek času potřebného ke srážení při slepé zkoušce a aby při nejvyšší koncentraci bylo dosaženo vyhovujícího průběhu závislosti log dávka-odezva, podle stanovení v předběžné zkoušce.

Do ledové voďní lázně se vloží dvanáct zkumavek po dvojicích označených T, , TZ a T3 pro dvojí měření tří ředění zkoušeného přípravku a S, , Sz a ~ pro dvojí měření tří ředění referenčního přípravku. Do každé zkumavky se odměří 1,0 ml rozmrazené plazmy substrátu RI a 1,0 ml vhodně zředěného zkoušeného přípravku nebo 1,0 ml vhoďně zředěného referenčního přípravku. Po každém přídavku se obsah zkumavek opatrně promíchá tak, aby se netvořily bubliny. Zkumavky v pořadí S, , S2, S3, T, , TZ a T3 se přenesou do vodní lázně o teplotě 37 °C na dobu 15 min. Poté se do každé zkumavky odměří 1 ml zkoumadla cefalinového R, ke kterému byl přidán vhodný aktivátor jako je kaolin, v takovém množství, aby srážení ve slepé zkoušce nastalo v čase kratším než 60 s. Při aktivaci kaolinem se bezprostředně před použitím připraví směs stejných objemů zkoumadla cefalinového R a suspenze kaolinu lehkého R (4 g/l) v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Přesně za 2 min se do každé zkumavky přidá 1 ml roztoku chloridu vápenatého R (3,7 g/l) a zvolenou metodou (a, b, c nebo d) se stanoví čas srážení v sekundách mezi tímto posledním přídavkem a začátkem srážení. Čas srážení ve slepé zkoušce se obdobně stanoví tak, že namísto roztoku heparinu se do zkumavky odměří 1 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Slepé zkoušky se zařadí na začátek a na konec postupu měření. Hodnoty stanovené pro dvojici slepých zlcoušelc se nemají významně lišit. Střední hoánoý časů srážení zaznamenaných pro jednotlivé dvojice se převedou do logaritmického tvaru. Postup se zopakuje za použití čerstvých roztoků, při dodržení pořadí pro inkubaci T, , T2, T3, S, , SZ a S3. Výsledky se vypočítají za použití obvyklých statistických metod.

Provedou se vždy nejméně tři nezávislá stanovení. Pro každé stanovení se připraví čerstvé roztoky referenčního přípravku, zkoušeného přípravku a jiné, čerstvě rozmražené plazmy. Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví z výsledků všech měření za použití obvyklých statistických metod. Jestliže rozptyl mezi jeďnotlivými stanoveními je významný na P = 0,01, může se stanovit výsledná účinnost výpočtem prostého průměru z jednotlivých stanovení.