2.7.6 Stanovení účinnosti adsorbonané vakcíny proti záškrtu.

Podstata zkoušky. Účinnost adsorbované vakcíny proti záškrtu se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně morčat před účinkem difterického toxinu s dávkou referenčního přípravku, vyjáďřenou v mezinárodních jednotkách, která poskytuje stejnou ochranu. Toxin se vstřikuje buf intradermálně a sleduje se vznik specifického erytému, nebo subkutánně a sleduje se úhyn zvířat.

Mezinároání jeánotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Tento standard pozůstává z určitého množství difterického toxoidu adsorbovaného na hyároxid hlinitý. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Metoda sledování erytému po intradermálním podání

Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí zdravá bílá morčata z jednoho chovu a takové velikostí, která umožní předepsaný počet injekčních podání. Rozďíl v hmotnosti mezi nej - těžším a nejlehčím zvířetem nepřesahuje 100 g. Zvířata se rozdělí do nejméně šesti stejně velkých skupin. Počet zvířat ve skupině postačuje k tomu, aby byly splněny dále předepsané požadavky na platnost zkoušky. Pokud není prokázána stabilita toxinu nebo tento toxin není dostatečně standardizován, přibere se pět morčat jako neimunizovaná kontrola. Morčata jsou stejného pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.

Výběr toxinu. Difterický toxin, který se použije ke zkoušce, obsahuje 67 až 133 Lr/100 v 1 Lf a 25 000 až 50 000 nejmenších dávek reagujících v kůži morčat v 1 Lf. Pokud je prokázána stabilita tohoto toxinu, není třeba ověřovat jeho účinnost při každém stanovení.

Příprava roztoku toxinu. Toxin se bezprostředně před použitím zředí vhodným rozpouštědlem tak, aby 0,2 ml obsahovalo asi 0,0512 Lf. Z něho se připraví řada pěti čýřnásobných ředění obsahujících asi 0,0128,0,0032,0,0008,0,0002 a 0,00005 Lf v 0,2 ml. Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. Zkoušený přípravek a referenční přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jeďnotlivá ředění byla odstupňována nejvýše 2, Snásobně a aby střední ředění při subkutánním podání (v dávce 1,0 ml na morče) dovolila po podání toxinu vznik intradermální reakce asi u tří ředění toxinu. Pro každé ředění se vybere jedna skupina morčat a všem morčatům ve skupině se subkutánně vstříkne po 1,0 ml příslušného ředění. Po 28 dnech se všem morčatům oholí oba boky a každému zvířeti se intradermálně vstříkne 0,2 ml každého z šesti ředění toxinu na šest různých míst tak, aby vzájemné působení sousedících míst bylo co nejmenší. Stanovení účinnosti toxinu. Je-li třeba, vstříknou se neimunizovaným kontrolním zvířatům roztoky obsahující 80,40,20,10 a 5 miliontin Lf toxinu.

Odečítání a hodnocení výsledků. 48 h po podání toxinu se vyšetří všechna místa podání a u každého zvířete se formou poměru zaznamená počet míst se specifickým diftericlcým erytémem a počet míst bez této reakce. Hodnoý těchto poměrů pro všechna zvířata, jimž bylo podáno stejné ředění očkovací látky, se spojí a zaznamenají do tabulky. Tyto údaje se vhodnou transformací, jako např. (hodnota poměru)2 nebo arcsin ((hodnota poměru/6~ ), použijí na získání odhadu relativní účinnosti každé zkoušené vakcíny pomocí kvantitativního hoďnocení rovnoběžných přímek. Požadavky na platnost zkoušky. Zkouška je platná, jsou-li splněny tyto požadavky: - zkoušená vakcína a referenční přípravek vykazují průměrný počet reakcí při nejnižší dávce nižší než tři a při nejvyšší dávce vyšší než tři, - je-li třeba, ředění toxinu obsahující 40 miliontin Lf dávky vyvolá pozitivní erytémovou reakci nejméně u 80 % kontrolních morčat a ředění obsahující 20 miliontin Lf dávky nevyvolá u nejméně 80 % kontrolních zvířat žáďnou reakci (nejsou-li splněna tato kritéria, vybere se jiný toxin), - interval spolehlivosti stanovení (P = 0,95) je v rozmezí 50 % až 200 % stanovené účinnosti, - statistické hodnocení neukazuje odchyllcu od linearity a rovnoběžnosti.

Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení, výsledky všech platných stanovení se sloučí.

Metoda sledování úhynu

Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí zdravá morčata o hmotnosti 250 g až 350 g pocházející z jednoho chovu. Morčata se rozděli do nejméně šesti stejně vellcých skupin. Počet zvířat ve skupině postačuje k tomu, aby byly splněny dále předepsané požadavky na platnost zkoušky. Pokud není prokázána stabilita toxinu nebo není-li tento toxin dostatečně standarďizován,

Přiberou se další čtyři skupiny po pěti morčatech jako neimunizovaná kontrola. Morčata jsou stejného pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.

Výběr toxinu. Vybere se takový difterický toxin, který v 1 ml obsahuje nejméně 100 LDso. Pokud je prokázána stabilita tohoto toxinu, není třeba ověřovat jeho střední smrtnou dávku při každém stanovení.

Příprava roztoku toxinu. Bezprostřeďně před použitím se toxin zředí vhodným rozpouštědlem tak, aby se získal roztok toxinu obsahující v 1 ml asi 100 LDso. Je-li třeba, zředí se dále část roztoku toxinu stejným rozpouštědlem v poměrech 1 : 32,1 : 100 a 1 : 320. Stanovení účinnosti vakcíny. Zkoušený přípravek a referenční přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění byla odstupňována nejvýše 2, Snásobně a aby střední ředění po sublcutánním podání (v dávce 1,0 ml na morče) ochránila přibližně 50 % zvířat před letálním účinkem předepsané dávky difterického toxinu podaného subkutánně. Pro každé ředění se vybere jedna skupina morčat a všem morčatům ve skupině se sublcutánně vstříkne po 1,0 ml příslušného ředění. Po 28 dnech se všem zvířatům subkutánně vstříkne 1,0 ml roztoku toxinu (100 LDso). Stanovení účinnosti toxinu. Je-li třeba, připraví se na podání roztoku toxinu a j eho tří ředění čtyři skupiny po pěti morčatech. Každému zvířeti ve skupině se subkutánně vstříkne 1,0 ml příslušného ředění toxinu.

Odečítání a hodnocení výsledků. Za 4 dny od podání toxinu se odečte počet přežívajících morčat. Účinnost zkoušené vakcíny se vyhodnotí porovnáním s účinností referenčního přípravku na základě poměru počtu přežívajících zvířat v každé skupině imunizovaných morčat, za použití obvyklých statistických metod.

Požadavky na platnostzkoušky. Zkouška je platná, jsou-li splněny tyto požadavky: - 50% ochranná dávka zkoušeného a referenčního přípravku je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou morčatům, - v případě, že čtyřem skupinám po pěti morčatech byl vstřílrnut roztok toxinu a j eho tři ředění, má počet uhynulých zvířat ukázat, že použitá dávka toxinu byla přibližně 100 LD sm - interval spolehlivosti stanovení (P = 0,95) je v rozmezí 50 % až 200 % stanovené účinnosti, - statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity a rovnoběžnosti.

Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení, výsledky všech platných stanovení se sloučí.