2.7.9 Zkouška na R funkci imunoglobulinu

Podstata zkoušky. Srovnání průběhu hemolýzy senzibilizovaných lidských červených krvinek v přítomnosti zkoušeného přípravku s průběhem hemolýzy v přítomnosti porovnávacího lidského imunoglobulinu.

Příprava zkoumadel Stabilizovaná lidská krev. Lidská krev skupiny 0 se odebere do antikoagulačního roztoku ACD. Stabilizovaná krev se uchovává při 4 °C nejdéle 3 týdny.

Tlumivý roztokfosforečnanový s chloridem sodným o pH 7,2. 1,022 g hydrofosforečnanu sodného bezvodého R, 0,336 g dihydrofosforečnanu sodného bezvodého R a 8,766 g chloridu sodného R se rozpustí v 800 ml vody R a zředí se jí na 1000 ml.

Zásobní roztok hořčíku a vápníku. 1,103 g chloridu vápenatého R a 5,083 g chloridu hořečnatého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.

Zásobní tlumivý roztok barbitalový. 207,5 g chloridu sodného R a 25,48 g barbitalu rodné soli R se rozpustí v 4000 ml vody R a pH se upraví kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na 7,3. Přidá se 12,5 ml zásobního roztoku hořčíku a vápníku a zředí se vodou R na 5000 ml. Roztok se filtruje membránovým filtrem (0,22 /, ~m) a uchovává při 4 °C ve skleněných obalech.

Tlumivý roztok barbitalu s albuminem. 0,150 g albuminu hovězího R se rozpustí v 20 ml zásobního tlumivého roztoku barbitalového a zředí se vodou R na 100 ml.

Roztok taninu. 10 mg taninu R se rozpustí ve 100 ml tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným o pH 7,2. Připravuje se bezprostředně před použitím.

Morčecí komplement. Z krve nejméně deseti morčat se připraví směrné sérum. Odděli se od sražené krve odstředěním při asi 4 °C. Sérum se uchovává v malých množstvích při teplotě nižší než -70 °C. Sérum se naředí tlumivým roztokem barbitalovém s albuminem na 125 až 200 CH s°v 1 ml bezprostředně před započetím hemolýzy účinkem komplementu a po dobu zkoušky se uchovává v lázni s ledem.

Antigen zarděnek. Voli se antigen zarděnek, který je vhodný na stanovení turu v hemaglutinačně inhibičním testu (turu HIT). Titr je větší než 256 HA jednotek.

Příprava taninovaných lidských červených krvinek. Z dostatečného objemu stabilizované lidské krve se odstředěním odděli lidské červené krvinky. Nejméně třikrát se promyjí tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,2. Připraví se 2% ( U/T~ suspenze v témže roztoku, jímž se naředí i 0,1 ml roztoku taninu na 7,5 ml (konečná koncentrace 1,3 mg/l). Smíchá se 1 objemový díl čerstvě naředěného roztoku taninu s 1 objemovým dílem suspenze červených krvinek a směs se inkubuje 10 min při 37 °C. Krvinky se oddělí odstředěním (10 min při 400 g až 800 g), supernatant se odstraní a červené krvinky se jednou promyjí tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,2. V tomtéž roztoku se taninované krvinky resuspendují na koncentraci 1 % ( Y/l~.

Taninované lidské červené krvinky s antigenem. Potřebný objem (VS) taninovaných krvinek se smíchá s antigenem zarděnek v poměru 0,2 ml antigenu na 1 ml suspenze krvinek. Po inkubaci 30 min při 37 °C se krvinky oddělí odstředěním (10 min při 400 g až 800 g). Supernatant se oddělí a ponechá se jen objem 200 , ul. Supernatant se nahradí stejným objemem tlumivého roztoku barbitalového s albuminem. Krvinky se resuspendují, oddělí se popsaným způsobem a promývací postup se opakuje. Zbylý objem 200 , ul se doplní na tři čtvrtiny objemu VS. Pro tento objem se zavede označení počáteční objem (V~. Z něho se odebere 100 , ul a zbylý objem se označí (Vr). K odebranému vzorku 100 , ul se přidá 900 , ul tlumivého roztoku barbitalového s albuminem a stanoví se počáteční absorbance (A) při 541 nm. Při naředění objemu (Vr) tlumivým roztokem barbitalovém s albuminem na A-násobnou hodnotu podle vzorce Vf= Vr x A se získá konečný nastavený objem senzibilizovaných červených krvinek (V~ a nastaví se na hodnotu 1,0 f 0,1 při desetinásobném ředění.

Vlastní zkouška

Tlazba protilátky na taninované lidské červené krvinky s antigenem. Následující roztoky se připravují postupně a dvojmo. Pro každý roztok se používá samostatná semimikrokyveta (např. na jedno použití) nebo zkumavka: 1. Zkoušené roztoky. Zkoušený přípravek se, pokud je to třeba, upraví hydroxidem sodným 1 mol/l RS na pH 7 a naředí se tlumivým roztokem barbitalovém s albuminem tak, aby obsahova130 mg až 40 mg imunoglobulinu a objem se upraví na 900 ~1. 2. Porovnávací roztoky. Připraví se stejným způsobem jako zkoušené roztoky zapoužití IidskéTio imunoglobulinu BF

Do každé kyvety nebo zkumavky se přidá 100 , ul suspenze senzibilizovaných lidských červených krvinek. Obsah se dobře promíchá.

Provede se inkubace 15 min při obyčejné teplotě, přidá se 1000 ~d tlumivého roztoku barbitalového s albuminem a buňky se oddělí odstředěním kyvet nebo zkumavek 10 min při 1000 g. Odstraní se 1900 , ul supernatantu a nahradí se 1900 , ul tlumivého roztoku barbitalového s albuminem. Celý promývací proces se opakuje. Supernatant se opět odstraní a nakonec se ponechá objem 200, u1. Zkoušené vzorky se mohou skladovat 24 h v dobře uzavřených kyvetách nebo zkumavkách při 4 °C.

Hemolýza vyvolaná komplementem. Před zahájením hemolýzy se přidá ke zkoušenému vzorku 600, u1 tlumivého roztoku barbitalového s albuminem, který se nejprve předehřeje na 37 °C. Buňky se pečlivě resuspendují opakovaným pipetováním (nejméně pětkrát) a kyveta se umístí do nosiče spektrofotometru vybaveného termostatem. Po 2 min se přidá 200 , ul morčecího komplementu nastaveného na 125 až 200 CHS~/ml. Obsah se důkladně promíchá dvojnásobným pipetováním. Po druhém pipetování se okamžitě začne zaznamenávat absorbance při 541 nm v závislosti na čase. Tlumivý roztok barbitalový s albuminem se používá jako srovnávací tekutina. Měření se zastaví, když časová závislost absorbance jasně překročí inflexní bod.

Hodnoceni Stanoví se strmost (S) křivky hemolýzy v inflexním bodě takto: Rozdělí se nejstrmější část na vhoďné časové intervaly 0t (například 0t = 1 min) a vypočte se S jako změna absorbance 0A jednoho časového intervalu (na příldad 0A za 1 min). Největší strmost je hledaná strmost v inflexním bodě (S~Xp). Stanoví se ještě absorbance na počátku měření (AS) extrapolací křivky, která je v prvních několika minutách téměř lineární a rovnoběžná s časovou osou. Strmost (SeXp) se koriguj e pomocí vzorce: S, =S~n AS

Vypočítá se aritmetický průměr korigovaných hoďnot strmosti (S) pro každý přípravek. Pro

Funkci R se vypočítá index (IF~) podle vzorce: 100 (S' - S~) SS - S~

V němž značí: S' - aritmetický průměr korigované strmosti zkoušeného přípravku, SŠ - aritmetický průměr korigované strmosti referenčního přípravku, S~ - aritmetický průměr korigované strmosti zjištěný v pokusech s kontrolou komplementu. Vypočtený index R funkce zkoušeného přípravku nemá být menší než hodnota uvedená v pří

Balovém letáku referenčního přípravku.