5.2.3 Humánní diploidní buňky pro výrobu humánních vakcín

2001

Tato obecná stať se zabývá diploidními buněčnými liniemi a kontinuálními buněčnými liniemi užívanými pro výrobu humánních vakcín; specifické postupy, vztahující se k vakcínám vyráběným rekombinantní DNK technologií, jsou popsány v článku Producta ab ADN recombinante. Zkoušení se provádí v různých stadiích (základní buňky, banka základních buněk, banka pracovních buněk, buňky používané pro výrobu ve stadiu maximálního zdvojení populace nebo za ním), jak je uvedeno v tabulce 5.2.3-1. Obecná opatřeni pro použití buněčných linií a zkušební metody jsou uvedeny níže.

Jestliže se pro výrobu vakcíny použijí primární buňky nebo buňky po několika pasážích bez ustavení buněčné banky, jsou požadavky uvedeny v jednotlivých článcích týkajících se vakcín.

Diploidní buněčné linie. Diploidní buněčné linie mají vysokou, ale konečnou kapacitu pro pomnožování in vitro.

Kontinuální buněčné linie. Kontinuální buněčné linie mají schopnost se nekonečně pomnožovat in vitro; buňky často mají odlišnosti v karyotypu ve srovnání s původními buňkami; mohou být získány ze zdravých nebo nádorových tkání. Pro vakcíny k injekčnímu podání vyráběné v kontinuálních buněčných liniích je purifikační proces validován k průkazu odstranění DNK z buněčného substrátu na úroveň nejvýše 10 ng v jedné lidské dávce, pokud není předepsáno jinak.

Systém buněčných bank. Výroba vakcín v diploidních nebo kontinuálních liniích je založena na systému buněčných bank. Věk buněk in vitro se počítá od banky základních buněk. Každá banka pracovních buněk je připravena z jedné nebo více nádob banky základních buněk. Použití, totožnost a kontrola obsahu nádob se pečlivě dokumentují.

Média a látky živočišného a lidského původu. Složení médií použitých pro izolaci a všechny následné kultury se detailně zaznamenávají a jestliže se použijí látky živočišného původu, jsou prosty cizorodých agens.

Je-li použit lidský albumin, vyhovuje článku Albumini humani solutio.

Bovinní sérum, použité pro přípravu a udržování buněčných kultur, se zkouší a prokáže se, že je sterilní a že v něm nejsou přítomny bovinní viry, jmenovitě virus bovinní diarhoey, ani mykoplazmata.

Trypsin použitý pro přípravu buněčných kultur se zkouší vhodnými metodami a prokáže se, že je sterilní a že neobsahuje mykoplazmata ani viry, jmenovitě pestiviry a parvoviry.

Buněčné inokolum. Údaje použité k posouzení vhodnosti buněčného inokula obsahují, kde je to dostupné, informace o jeho původu a vývoji a charakteristiku.

Původ buněčného inokula. Pro lidské buněčné linie se zaznamenávají následující informace o dárci: etnický a zeměpisný původ, věk, pohlaví, celkový fyziologický stav, použitá tkáň nebo použitý orgán a výsledky zkoušek na patogeny. Pro živočišné buněčné linie se zaznamenávají následující informace o původu buněk: druh, kmen, podmínky chovu, zeměpisný původ, věk, pohlaví, celkový fyziologický stav, použitá tkáň nebo použitý orgán, výsledky zkoušek na patogeny.

Buňky nervového původu, jako např. linie buněk neuroblastomu a buněk P12, mohou obsahovat látky, ve kterých jsou koncentrována agens spongioformní encefalopatie. Takové buňky se nepoužívají pro výrobu vakcín.

Vývoj buněčného inokula. Zaznamenávají se následující informace: metoda použitá k izolaci buněčného inokula, kultivační metody a ostatní postupy vedoucí k ustavení banky základních buněk, zvláště pak možná expozice buněk cizorodým agens.

Pokud není k dispozici úplná informace o složkách médií použity"ch v minulosti ke kultivaci buněk, např. o původu látek živočišného původu, kde je předepsáno a schváleno, mohou se již zavedená buněčná inokula používající tato média použít pro výrobu vakcíny.

Charakteristika buněčného inokula. Jsou zkoumány následující vlastnosti:

(1) totožnost buněk (např. izoenzymy, sérologie, otiskové mapy nukleových kyselin);

(2) růstové charakteristiky buněk a jejich morfologické vlastnosti (světelná a elektronová mikroskopie);

(3) karyotyp diploidních buněčných linií;

(4) pro linie diploidních buněk životnost linie in vitro v termínech zdvojení populace.

Stabilita buněčného substrátu. Prokáže se vhodná životaschopnost buněčné linie v zamýšlených podmínkách uchování. Pro daný přípravek, jenž má být připraven na buněčné linii, je nezbytné prokázat, že může být dosažena homogenní výroba s buňkami ve výchozí i konečné pasáži v zamýšleném rozsahu použití.

Infekční cizorodá agens. Buněčné linie pro výrobu vakcíny jsou prosty infekčních cizorodých agens. Zkoušky na nepřítomnost cizorodých agens se provedou podle tabulky 5.2.3-1.

V závislosti na původu a vývoji buněčné linie je nezbytné provést zkoušky na vybrané specificky potenciální kontaminanty, zvláště na ty, o nichž je známo, že mohou latentně infikovat druh dárce, např. virus SV 40 druh Macaca. Pro buněčné linie původem z hlodavců se zkoušky tvorby protilátek provádějí na myších, potkanech a křečcích, aby se detegovaly druhově specifické viry.

Buněčné linie se zkoušejí na přítomnost retrovirů, jak je popsáno níže. Buněčné linie, které vykazují přítomnost retrovirů schopných repíikace, nejsou použitelné pro výrobu vakcín.

Tumorogenita. Pro přípravu živých vakcín nesmí buněčná linie být tumorogenní v žádné hladině zdvojení použité pro výrobu vakcíny. Při použití tumorogenní linie pro výrobu jiných typů vakcín je purifikační proces validován k průkazu redukce reziduální DNK z buněčného substrátu na méně než 10 ng na jednu lidskou dávku, a na snížení bílkovin buněčného substrátu na přijatelnou úroveň.

Buněčné linie se známým tumorogenním potenciálem nemusí být dále zkoušeny. Buněčné linie, u nichž není tumorogenní potenciál znám, jsou považovány za tumorogenní nebo se přezkoušejí na tumorogenitu in vitro zkouškou popsanou dále; je-li výsledek zkoušky in vitro negativní nebo nejasně pozitivní, provede se zkouška in vivo uvedená dále. Tyto zkoušky se provádějí s buňkami v úrovni maximálního zdvojení populace, která bude použita při výrobě vakcíny. Buněčné linie MRC-S, WI-38 a FRhL-2 jsou uznány jako netumorogenní a následné zkoušky není třeba provádět.

Chromozomální charakteristika. Linie diploidních buněk musí být prokazatelně diploidní. Rozsáhlejší charakteristika diploidních buněčných linií analýzou karyotypu se vyžaduje, není-li validováno odstranění intaktních buněk při výrobě po sklizni. Zkouší se vzorky ze čtyř úrovní pasáží rovnoměrně odebíraných během životního cyklu buněčné linie. Zkouší se minimálně 200 buněk v metafázi na přesný počet chromozomů a frekvenci hyperploidie, hypoploidie, polyploidie, zlomů a strukturálních abnormalit.

Buněčné linie MRC-5, WI-38 a FRhL-2 se považují za diploidní a dobře charakterizované; nejsou-li geneticky modifikované, další charakteristika není nutná.

Zkušební metody pro buněčné kultury

Zkouška totožnosti. Použije se analýza voskové mapy nukleových kyselin a odpovídající výběr z následujících metod ke stanovení totožnosti buněk:

I. biochemická charakteristika (analýza izoenzymů),

2. imunologická charakteristika (antigeny tkáňové slučitelnosti), 3. cytogenetické markery.

Kontaminující buňky. Analýza otisku mapy nukleových kyselin provedená ve zkoušce totožnosti slouží také k průkazu nepřítomnosti kontaminujících buněk.

Bakteriální a houbová kontaminace. Banka základních buněk a každá banka pracovních buněk vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1) provedené s použitím 10 ml supernatantní tekutiny z buněčných kultur na každou živnou půdu. Provede se zkouška 1 °/o obalů, nejméně dva obaly.

Mykoplazmata. (2.6.7). Banka základních buněk a každá banka pracovních buněk vyhovuje zkoušce na mykoplazmata kultivační metodou a metodou indikátorových buněčných kultur. Ve zkoušce se použije jedna nebo více nádob.

Zkouška na cizorodá agens v buněčných kulturách. Buňky vyhovují zkoušce na hemadsorbující viry a zkouškám buněčných kultur na cizorodá agens, popsaným ve stati 2.6.16 v odstavci Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky. Jsou-li buňky opičího původu, inokulují se do kultur buněk králičích ledvin k průkazu herpesviru B (cerkopitecidní herpesvirus 1).

Souběžná kultivace

Souběžně se odděleně kultivují celistvé a porušené buňky v různých buněčných systémech, včetně lidských a opičích buněk. Provedou se zkoušky k detekci možných morfologických změn. K detekci hemaglutinujících virů se provedou zkoušky na médiu z tkáňových kultur. Buňky vyhovují zkoušce, nejsou-li nalezeny žádné známky cizorodých agens.

Retroviry

Přítomnost retrovirů se zkouší použitím: 1. zkoušky infekčnosti,

2. transmisní elektronové mikroskopie,

3. jestliže zkoušky 1. a 2. dávají negativní výsledky, provede se zkouška na reverzní transkriptasu (za přítomnosti hořčíku a manganu) v usazenině získané při vysokootáčkovém odstřed'ování.

Zkoušky na zvířatech. Každé z následujících skupin zvířat se vstříkne intramuskulárně (nebo sajícím myším subkutánně) 107 živých buněk rozdělených stejnoměrně mezi zvířata v každé skupině:

1. dvěma vrhům sajících myší mladších než 24 hodin, každý nejméně o deseti zvířatech, 2. deseti dospělým myším.

lntracerebrálně se vstříkne každé z deseti dospělých myší 106 živých buněk k detekci možné přítomnosti viru lymfocytární choriomeningitidy.

Zvířata se pozorují nejméně 4 týdny. Sleduje se, zda nezeslábnou nebo zda nevykazují abnormality, které by mohly být příčinou onemocnění. Buňky v této zkoušce vyhovují, pokud nejsou nalezeny známky výskytu cizorodých agens. Zkouška je neplatná, jestliže méně než 80 % zvířat z každé skupiny zůstane zdravých a přežije do konce doby pozorování.

Pro buňky získané z různých druhů hlodavců (např. ovariální buňky čínského křečka nebo buňky ledvin mláděte křečka) se zkoušky na protilátky proti možným virovým kontaminantám dotyčného druhu provedou injekcí buněk do zvířete stejného druhu.

Zkoušky na vejcích. Použije se Inokulum 106 buněk na vejce, buňky se vstříknou do alantoidní dutiny deseti SPF kuřecích embryí (5.2.2) starých 9 až 11 dní. Dále se injikují do žloutkového vaku deseti SPF kuřecích embryí starých 5 až 6 dní. Inkubují se nejméně 5 dní. Zkouška alantoidní tekutiny na přítomnost hemaglutininů se provede savčími a ptačími červenými krvinkami: zkouška se provádí při (5 ±3) °C a 20 °C až 25 °C a výsledky se odečítají po 30 a 60 minutách. Buňky vyhovují zkoušce, nejsou-li nalezeny známky přítomnosti cizorodých agens. Zkouška je neplatná, jestliže méně než 80 % embryí zůstane zdravých a přežije do konce doby pozorování.

Zkouška tumorogenity in vitro. Mohou se použít následující zkušební systémy: 1. tvorba kolonií na měkkém agarovém gelu,

2. vytváření invazivního buněčného růstu po inokulaci do orgánových kultur,

3. studie transformační aktivity s použitím např. systému 3T3 pro aktivní onkogeny.

Zkoušky tumorogenity in vivo

Zkouška spočívá v tom, že se zavede porovnání buněčné linie s vhodnou pozitivní kontrolou (např. HeLa nebo Hep2 buňky).

Živočišné systémy prokazatelně vhodné pro tuto zkoušku zahrnují: 1. bezthymové myši (genotyp Nu/Nu),

2. novorozené myši, potkany nebo křečky ošetřené antithymocytárním sérem nebo globulinem, 3. bezthymové a ozářené myši (T-, B+) naočkované kostní dření zdravých myší.

Po zvolení živočišného systému se buněčná linie a referenční linie injikují odděleně dvěma skupinám zvířat po 10 jedincích. Inokulum pro každé zvíře je 10~ buněk suspendovaných v objemu 0, 2 ml a vstříkne se bud' intramuskulárně, nebo subkutánně. Novorozeným myším se vstříkne po 0, 1 ml antithymocytárního séra nebo globulinu ve dnech 0, 2, 7, 9 a 14 po narození.

Účinné sérum nebo globulin potlačí imunitní mechanismus rostoucích zvířat do té míry, že následující Inokulum 107 pozitivních referenčních buněk často produkuje nádory a metastázy.

Některé nemocné myši zřetelně vykazují progresivně rostoucí tumor a utratí se před koncem zkoušky, aby se zabránilo zbytečnému utrpení.

Na konci pozorovacího období se usmrtí všechna zvířata, včetně kontrolní skupiny, a vyšetřuje se celková a mikroskopická přítomnost proliferace inokulovaných buněk v místě vpichu i na jiných místech (např. lymfatické uzliny, plíce, ledviny a játra).

Ve všech zkušebních systémech se zvířata v pravidelných intervalech pozorují a ryšetřují pohmatem na tvorbu uzlin v místech vpichu. Jakékoliv vytvořené uzliny se měří ve dvou vzájemně kolmých rovinách a měření se pravidelně zaznamenávají, aby se stanovilo, zda se jedná o progresivní růst uzliny. Zvířata s uzlinami vykazujícími regresi během pozorovacího období jsou utracena dříve, než se uzliny stanou nehmatnými, a podrobí se histologickému vyšetření. Zvířata s progresivně rostoucími uzlinami se pozorují 1 až 2 týdny. Ze zvířat bez tvorby uzlin se polovina pozoruje 3 týdny a polovina 12 týdnů před usmrcením a zpracováním na histologické vyšetření. Pitvá se každé zvíře, včetně ryšetření na celkový důkaz tvorby tumoru v místě vpichu a v jiných orgánech, jako jsou lymfatické uzliny, plíce, mozek, slezina, ledviny a játra. Všechny léze podobné tumoru a místo vpichu se vyšetří histologicky. Protože některé buněčné linie mohou tvořit metastázy bez známek místního nádorového růstu, vyšetří se jakékoliv zjistitelné regionální lymfatické uzliny a plíce všech zvířat histologicky.

Zkouška není platná, jestliže méně než devět z deseti zvířat naočkovaných pozitivními referenčními buňkami rykazuje progresivně rostoucí tumor.

Tab. 5.2.3-1 Zkoušení buněčných linií

Zkouška Buněčné ino- Banka Banka Buňky použité

kulum základních pracovních pro výrobu ve

buněk buněk stadiu maximál

ního zdvojení

populace nebo za

ním

1. TOTOŽNOST A ČISTOTA

morfologie + + + +

relevantní výběr následujících + + + +

zkoušek: biochemické (např. isoenzytny),

imunologické: např. histokompatibilita),

cytogenetické markery,

otiskové ma nukleov'ch k selin

ka o (di loidní buněčné linie) + + +~~~ + ~~~

životnost {di loidní buněčné linie - + + -

2. CIZORODÁ AGENS

bakteriální a houbová kontaminace - + + -

mykoplazmata - + + -

zkoušky v buněčných kulturách - - + -

souběžná kultivace - - +2 +

zkoušky na zvířatech a vejcích - - +Z +

specifické zkoušky na možné - - +Z +Z

kontaminanty závisející na původu

buněk (viz Infekční cizorodá a ens)

retroviry - + ' - +

3. TUMOROGENITA

tumorogenita _ - - +a

Vysvětlivky

1. Diploidní charakter se určí pro každou banku pracovních buněk, ale za použití buněk použitých pro výrobu ve stadiu maximálního zdvojení populace, nebo za ním.

2. Zkoušení se provádí pro každou banku pracovních buněk, ale použití buněk použitých pro ryrobu ve stadiu maximálního zdvojení populace nebo za ním.

3. Zkoušení se provádí pro banku základních buněk, ale za použití buněk použitých pro ry."robu ve stadiu maximálního zdvojení populace nebo za ním.

4. Buněčná linie MRC-5, buněčná linie WI-38 a buněčná linie FRhL-2 se nepovažují za tumorogenní a nemusí se zkoušet. Zkoušky buněčných linií, o nichž je známo, že jsou tumorogenní, nebo o nichž se to předpokládá, se neprovádějí.