5. 3   Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek

2000

Obsah

1 Úvod

Tato stať provádí problematikou plánování a hodnocení biologických zkoušek předepsaných v lékopise.Je určena těm, kteří nejsou profesionální statistici a nezodpovídají za metodiku statistických analýz, ale zodpovídají za analýzu a interpretaci výsledků zkoušek, často prováděných bez pomoci nebo spoluúčasti statistika. Metody popsané v této příloze nejsou závazné pro analýzu výsledků biologických zkoušek, které jsou obsaženy v závazné části lékopisu. Mohou být používány i jiné metody, pokud nejsou méně spolehlivé než ty, které jsou zde popsané. V současné době je dostupné velké množství počítačových programů, jejichž použití je užitečné v závislosti na dostupných možnostech a zkušenosti analytika.

Odborné statistické návrhy řešení by měly být použity, pokud:

• je vhodné provést podrobnou analýzu pro účely výzkumu nebo vývoje nového přípravku;
• je požadována analýza obecné nelineární závislosti odpovědi na dávce, např. při hodnocení imunoesejí;
• nejsou splněny požadavky stati na plán zkoušky uvedené v této stati, např. dílčí laboratorní omezení mohou vyžadovat speciální plán zkoušky, nebo není možno dodržet požadavek stejných počtů opakování pro ekvidistanční dávky podnětu stejných dávek zkoušky.

1.1 Obecný plán zkoušky a přesnost

Biologické metody jsou určeny pro zkoušení látek a přípravků, jejichž účinnost se nedá spolehlivě zjistit chemickými nebo fyzikálními metodami. Všude, kde je to možné, se ve zkouškách užívá princip porovnání se standardním přípravkem. Určuje se množství zkoušeného přípravku, které vyvolá stejný biologický efekt jako dané množství, jednotka referenčního přípravku. Pro tyto metody biologických zkoušek je nezbytné, aby zkouška standardního a zkouška zkoušeného přípravku byly provedeny ve stejném čase a za stejných podmínek.

V některých zkouškách (např. při určení titru virů) není účinnost zkoušeného vzorku vyjádřena relativně vzhledem ke standardu. Tento typ zkoušek je popsán v části 4.5.

Každý odhad účinnosti určený biologickou zkouškou má náhodnou chybu, tkvící v biologické variabilitě odpovědí. Tato chyba by se měla, je-li to možné, stanovit z výsledků každé zkoušky, i pokud je použita oficiální metoda. Metody plánování zkoušek a výpočet jejich chyb jsou proto popsány níže. Vždy před zavedením statistické metody je nutné pomocí předběžné zkoušky stanovit dostatečný rozsah zkoušky (tj. dostatečné množství vzorků).

Interval spolehlivosti pro účinnost udává přesnost, s jakou byla sledovaná účinnost ve zkoušce odhadnuta. Je sestrojen s ohledem na plán a rozsah zkoušky. V biologických zkouškách bývají obvykle používány 95% intervaly spolehlivosti. Pro výpočet hranic intervalů spolehlivosti bývají používány metody matematické statistiky, které zajišfují, že s 95% pravděpodobností tento interval obsahuje skutečnou hodnotu účinnosti. To, zda je tato přesnost přijatelná pro lékopis, závisí na požadavcích popsaných v příslušném lékopisném článku.

Pojmy „průměr" a „směrodatná odchylka" jsou zde použity tak, jak jsou definovány v běžných biometrických učebnicích.

Výrazy „udaná účinnost" nebo „deklarovaná účinnost", „referenční účinnost", „předpokládaná účinnost", „relativní účinnost" a „stanovená účinnost" jsou použity v tomto smyslu:

• „udaná účinnost" nebo „deklarovaná účinnost" označují u předepsaného přípravku jmenovitou hodnotu, určenou ze znalosti účinnosti materiálu, u hromadně vyrobeného materiálu z účinnosti stanovené výrobcem,
• „referenční účinnost" - účinnost referenčního přípravku;
• „předpokládaná účinnost" - dočasně předpokládaná účinnost zkoušeného přípravku, používá se pro výpočet dávky, jejiž účinek by měl být odpovídající s použitou dávkou referenčního přípravku;
• „relativní účinnost" přípravku o neznámé účinnosti je podíl stejně účinných dávek referenčního a zkoušeného přípravku;
• „stanovená účinnost" je účinnost vypočítaná z výsledků zkoušky.

V části 9 (Slovník symbolů) je seznam nejdůležitějších symbolů použitých v této příloze. Tam, kde jsou v textu použity symboly, které nejsou popsány v této kapitole nebo jsou použity v jiném smyslu, je to uvedeno v dané části textu.

2 Náhodnost a nezávislost jednotlivých ošetření

Výběr různých ošetření pro různé pokusné jednotky (zvířata, zkumavky atd.) by se měl provést čistě náhodně. Náhodně by se měl provést i každý jiný výběr pokusných podmínek, nebyl-li pokusným plánem úmyslně jinak stanoven. Příkladem je výběr polohy klecí v laboratoři a pořadí, v němž se provede ošetření. Konkrétně: skupina zvířat, která obdrží stejnou dávku, by neměla být ošetřena společně (ve stejném čase a místě), pokud není spolehlivý důkaz, že tyto zdroje nehomogenity (např. rozdíly v čase nebo místě) jsou zanedbatelné. Náhodné uspořádání může být vytvořeno pomocí v počítačích zabudovaných generátoru náhodných čísel. Analytik si musí ověřit, zda při každém použití příslušného programu získá jinou řadu čísel.

Příprava všech pokusných jednotek má být nezávislá, jak je to nejvíce možné. V každé pokusné skupině nemá být ředění přidělené ke každému ošetření vytvořeno dělením stejné dávky, ale má být připraveno individuálně. Bez tohoto předpokladu by nebyla variabilita tvořená přípravou vzorku plně obsažena ve variabilitě prováděné zkoušky. Výsledkem by bylo podhodnocení reziduální chyby, což má za následek:

1. neoprávněný nárůst přesnosti zkoušky v analýze rozptylu (viz části 3.2.3 a 3.2.4),
2. podhodnocení skutečných mezí spolehlivosti pro zkoušku, pro kterou byl použit odhad reziduálního rozptylu sZ (viz část 3.2.5).

3 Zkoušky závislé na kvantitativní odpovědi

3.1 Statistické modely

3.1.1 Obecné principy

Biologické zkoušky obsažené v lékopise jsou založeny na principu „ředění". O neznámém zkoušeném přípravku se předpokládá, že obsahuje stejnou aktivní složku jako referenční přípravek, ale s jiným poměrem aktivní a neúčinné složky. Teoreticky je v tomto pripadě neznámý přípravek pouze ředěním referenčního přípravku pomocí nějaké neúčinné látky. Má-li se ověřit, zda se konkrétní právě prováděná zkouška řídí tímto modelem, je nutné porovnat závislost odpovědi na ředění přípravku i standardu. Pokud se v prováděné zkoušce výrazně liší průběh závislosti na dávce referenčního a neznámého přípravku, není tento model, užívající princip ředění pro tuto konkrétní zkoušku, vhodný. Významný rozdíl v závislosti na dávce u standardu a zkoušených přípravků může znamenat, že některý z přípravků obsahuje další aktivní složku, která není inertní, ale která ovlivňuje měřenou odpověď.

Aby bylo možno lépe analyzovat vliv ředění na biologickou odpověď, je vhodné transformovat závislost dávka-odpověd' na lineární funkci na nejširším možném rozsahu dávek. Pro statistickou analýzu biologických zkoušek jsou určeny dva modely: model rovnoběžnosti a model poměru sklonů.

Jejich použití je závislé na následujících podmínkách:

1. pokusným jednotkám jsou náhodně přidělena jednotlivá ošetření,
2. odpověď každého ošetření má normální rozdělení,
3. směrodatná odchylka odpovědí v jednotlivých skupinách, jak standardu, tak i neznámého přípravku, se navzájem statisticky významně neliší.

Při navrhování metodiky konkrétní zkoušky musí analytik zajistit, aby data sbíraná v mnoha zkouškách splňovala tyto teoretické předpoklady.

Podmínku 1 lze splnit správným použitím návodu z části 2.

Podmínka 2 je v praxi téměř vždy splněna. Pokud je provedeno více opakování pro každé ošetření, nezpůsobí malé odchylky od tohoto předpokladu obecně vážné selhání těchto metod hodnocení. Při podezření může být proveden test odchylky od normality (např. Shapiro-Wilk test¹⁾).

Podmínka 3 může být ověřena testem homogenity rozptylů (např. Bartlettův test²⁾ nebo Cochranův test³⁾). Pro tyto účely je též velmi užitečné použít grafického zobrazení dat (viz příklady v části 5).

Pokud nejsou splněny podmínky 2 a/nebo 3, může se splnění těchto podmínek zlepšit vhodnou transformací. Příkladem je např. ln y , √ y nebo y².

• Logaritmická transformace odpovědi y na ln y, pokud není splněn předpoklad homogenity rozptylů. Transformace též vylepší shodu s předpokladem normality, pokud je rozložení skloněné doprava.
• Transformace y na √ y je užitečná, pokud pozorování mají Poissonovo rozdělení, tj. pokud pozorované hodnoty představují počty.
• Transformace y na y² je vhodná, pokud např. odpověď více odpovídá ploše inhibiční zóny než jejímu průměru. Existuje ještě další skupina zkoušek, u kterých není možno měřit odpověď každé pokusné jednotky, ale je možné zjistit pouze procento jednotek reagujících na každé testované ošetřeni. Tyto zkoušky jsou popsány v části 4.

3.1.2 Rutinní zkoušky

Pokud je již zkouška prováděna rutinně, lze zřídka možno systematicky ověřovat splnění podmínek 1 až 3, protože omezené množství pozorování ve zkoušce může ovlivnit citlivost statistických testů. Statistici však prokázali, že při symetrickém uspořádání zkoušky neovlivni malé odchylky od předpokladu normality a shody rozptylů výrazně výsledek hodnocení zkoušky. Pokud řada zkoušek dává pochybné výsledky, je nutno opětovně posoudit vhodnost použitého statistického modelu. Pak je nutno provést novou sérii předběžných hodnocení, jak je diskutováno v části 3.1.1.

Další dvě nezbytné podmínky závisí na zvoleném statistickém modelu:
Pro model rovnoběžné lineární závislosti:

4A) Závislost odpovědi na logaritmu dávky je možno popsat pomocí přímky v rozsahu všech použitých dávek.

5A) Pro každý neznámý přípravek musí být přímka závislosti odpovědi na logaritmu dávky rovnoběžná s přímkou závislosti standardu.

Pro model poměru sklonů:

4B) Závislost odpovědi na dávce pro každý přípravek ve zkoušce je možno v rozsahu všech použitých dávek popsat pomocí regresní přímky.

5B) Pro všechny zkoušené přípravky musí regresní přímky protínat osu y (v dávce nula) ve stejném bodě jako přímka referenčního přípravku (tj. regresní funkce všech přípravků ve zkoušce musí mít stejný průsečík s osou y jako regresní přímka standardu).

Podmínky 4A a 4B je možno v rámci zkoušky ověřit pouze, pokud je každý přípravek ve zkoušce testován alespoň ve třech ředěních. Provádění zkoušek, v kterých jsou použita pouze dvě nebo jedno ředění, je možné pouze, jsou-li předpoklady linearity, rovnoběžnosti nebo stejného průsečíku prověřeny minulou zkušeností.

Po získání dat zkoušky (ale před výpočtem relativní účinnosti každého zkoušeného přípravku) musí být proveden výpočet analýzy rozptylu, která ověřuje splnění předpokladů 4A a SA (nebo 4B a SB). K tomuto účelu je rozdělen součet čtverců na dílčí součty, které odpovídají požadavku splnění jednotlivých podmínek. Zbývající součet čtverců odpovídá reziduální chybě, která umožní pomocí skupiny dílčích F-testů hodnotit jednotlivé zdroje variability.

Pokud je ověřena použitelnost metody, je možno vypočítat účinnost každého zkoušeného přípravku v porovnání se standardem a vyjádřit ji buďto jako relativní účinnost, nebo v jednotkách vhodných pro zkoušený přípravek, např. v mezinárodních jednotkách (m.j.) (IU International Units). Z každé skupiny dat zkoušky je možno vypočítat i meze spolehlivosti.

Zkoušky založené na modelu rovnoběžnosti jsou popsány v části 3.2 a na modelu poměru sklonů v části 3.3.

Když není splněna některá z pěti podmínek (1, 2, 3, 4A, 5A nebo 1, 2, 3, 4B, 5B), jsou zde popsané metody nepoužitelné a mělo by se prověřit technické provedení zkoušky.

Analytik by neměl použít jinou transformaci, není-li prokázáno, že nesplnění předpokladů není náhodné, ale že je způsobeno systematickou změnou laboratorních podmínek. V tomto případě by mělo být před použitím nové transformace v rutinním provozu znovu provedeno testování tak, jak je popsáno v části 3.1.1.

Pokud se při provádění rutinních zkoušek pro porovnání podobných materiálů vyskytuje zvýšený počet zkoušek neplatných kvůli nerovnoběžnosti a nelinearitě, je možnou příčinou to, že plán zkoušky dostatečně neodráží danou situaci. Tento nedostatek je často způsoben neschopností určit všechny zdroje variability, které ovlivňují zkoušku. To může způsobit podhodnocení reziduální chyby, což vede k vysokým hodnotám testovací statistiky F-testu.

V jedné zkoušce není vždycky možné uvažovat všechny možné zdroje variability (např. rozdíly mezi dny). V tom případě se intervaly spolehlivosti získané opakováním zkoušky mohou výrazněji lišit a je třeba opatrnosti při používání dílčích intervalů spolehlivosti. K získáni spolehlivějšího odhadu intervalů spolehlivosti se musí provést více nezávislých zkoušek a z těch pak kombinovat jeden odhad účinnosti a jeho interval spolehlivosti (viz část 6).

Pro účely kontroly kvality rutinních zkoušek se doporučuje zaznamenávat hodnoty sklonu regresní přímky a reziduální chyby pro zobrazení v grafu kontroly kvality zkoušek.

• Výjimečně vysoké hodnoty reziduální chyby mohou poukazovat na technické problémy. To by mělo být prověřeno a pokud došlo k evidentnímu pochybení v průběhu pokusu, musí být zkouška opakována. Neobvykle vysoká reziduální chyba může také indikovat přítomnost odlehlého nebo vychýleného pozorování. Odpověď, která je v průběhu zkoušky podezřelá z důvodu, že neodpovídá průběhu zkoušky, musí být vyřazena. Je-li odlehlá hodnota zjištěna až po zaznamenání naměřených hodnot, ale je možno vystopovat neregulérnosti zkoušky, může být vynechání této hodnoty oprávněné. Libovolné vypouštění naměřených hodnot ze zpracování může ale způsobit vážné zkreslení. Obecně lze pozorování bez obav vyloučit pouze, pokud je test odlehlých pozorování statisticky významný.
• Někdy se mohou objevit i výjimečně nízké hodnoty reziduální chyby. Ty pak způsobí, že F-hodnota snadno překročí kritickou hodnotu. V této situaci může být oprávněné nahradit reziduální chybu vypočtenou v této zkoušce průměrnou reziduální chybou z historických dat v grafu kontroly kvality zkoušek.

3.1.3 Výpočty a omezení

Z pohledu obecných principů optimálního plánování zkoušek se obvykle kladou tři požadavky, které zjednodušují výpočet a zvyšují přesnost výsledků.

1. Každý přípravek ve zkoušce musí být testován na stejném počtu ředění;
2. V modelu rovnoběžnosti musí být podíl sousedních dávek konstantní pro všechna ošetření ve zkoušce; v modelu poměru sklonů musí být vzdálenost mezi sousedními dávkami konstantní pro všechna ošetření.
3. Pro každé ošetření musí být použit stejný počet pokusných jednotek.

Pokud je použit plán, splňující tato omezení, zjednoduší se algoritmus výpočtu - příslušné vzorce jsou v části 3.2 a 3.3. Doporučuje se však využití programů vyvinutých speciálně pro tyto účely. Existuje mnoho programů, které umí jednoduše pracovat se všemi plány zkoušek obsažených v tomto textu. Ne všechny programy používají identické algoritmy, ale měly by poskytovat stejné výsledky.

Plán zkoušky, který nesplňuje výše zmíněné požadavky, je také použitelný, ale vzorce potřebné pro výpočet jsou příliš komplikované pro prezentaci v tomto textu. Jejich krátký popis je zmíněn v části 7.1. Mohou být použity pro zjednodušený plán zkoušky. Pak poskytují stejné výsledky jako zjednodušené algoritmy.

Vzorce pro zjednodušený plán zkoušek popsané v tomto textu mohou být použity např. pro vytvoření vlastních programů v tabulkových kalkulátorech. Příklady v části 5 pak mohou být použity pro ověření, zda vytvořený program poskytuje správné výsledky.

3.2 Model rovnoběžnosti

3.2.1 Úvod

Model rovnoběžnosti je zobrazen na obrázku 3.2.1-1. Na horizontální ose jsou vyneseny hodnoty logaritmu dávky (vlevo nejnižší a vpravo nejvyšší koncentrace). Na svislé ose jsou zobrazeny hodnoty příslušných odpovědí. Jednotlivé odpovědi jsou pro každou koncentraci zobrazeny pomocí černých bodů. Zobrazené dvě přímky představují vypočtenou lineární závislost odpovědi na dávce pro zkoušený a referenční přípravek.

Obr. 3.2.1-I Model rovnoběžnosti pro zkoušku 3 + 3

Poznámka: V této stati je používán přirozený logaritmus (ln nebo log_e). Kdekoliv je použito slovo „antilogaritmus" nebo „odlogaritmování", je tím míněna funkce e^x. Může být ale použit i „Birggův" neboli dekadický logaritmus (log nebo log₁₀), odpovídající antilogaritmus je 10^x.

Pro uspokojivě dobrý plán zkoušky je nutné, aby předpokládaná účinnost byla blízko skutečné účinnosti. Na základě předpokládané a stanovené účinnosti referenčního přípravku jsou připravena navzájem odpovídající ředění, tj. jsou připravena ředění standardu a zkoušeného přípravku tak, aby dávala stejnou odpověď. Pokud není k dispozici informace o předpokládané účinnosti, musí se provést předběžná zkouška v širokém rozsahu dávek, aby se stanovil obor, kde je závislost lineární.

Čím přesněji aproximuje předpokládaná účinnost neznámého přípravku jeho skutečnou hodnotu, tím blíže jsou obě přímky; srovnatelné dávky by měly dávat i srovnatelnou odpověď. Vodorovná vzdálenost přímek představuje odchylku „skutečné" účinnosti od předpokládané. Čím větší je vzdálenost mezi oběma přímkami, tím horší je odhad původní předpokládané účinnosti zkoušeného přípravku. Pokud je přímka neznámého přípravku vpravo od přímky standardu, je předpokládaná účinnost nadhodnocena a výpočtem byla získána nižší hodnota odhadované účinnosti, než se předpokládalo. Podobně, jestliže je přímka zkoušeného přípravku vlevo od přímky standardu, je předpokládaná účinnost podhodnocena a výpočet poskytne vyšší odhadovanou účinnost, než je předpokládaná.

3.2.2 Plány zkoušky

Pro optimalizaci plánu zkoušky jsou užitečné následující úvahy:

1. poměr mezi sklonem regresní přímky a reziduální chybou by měl být pokud možno co největší,
2. rozsah dávek by měl být pokud možno co největší,
3. regresní přímky by měly být pokud možno co nejblíže, tj. předpokládaná účinnost by měla být dobrým odhadem skutečné účinnosti.

Přiřazení pokusných jednotek (zvířat, zkumavek apod.) jednotlivým ošetřením může být provedeno různým způsobem.

3.2.2.1 Úplné znáhodnění

Pokud je soubor pokusných jednotek (zvířat, zkumavek apod.) dostatečně homogenní a pokud nelze předem nalézt části souboru s menší variabilitou odpovědí, může být ošetření jednotlivým pokusným jednotkám přiřazeno náhodně. Když jsou podskupiny jednotek homogennější než celek, např. vlivem tělesného stavu nebo pokusného dne, může být přesnost zkoušky zvýšena zavedením dalších omezení v pokusném plánu. Pečlivé vyvážení plánu s ohledem na tyto okolnosti zajistí eliminaci vedlejších zdrojů varia-bility.

3.2.2.2 Náhodné bloky

Pomocí tohoto plánu se mohou vyloučit známé zdroje variability, jako např. rozdíl mezi jednotlivými vrhy pokusných zvířat nebo rozdíl mezi jednotlivými Petriho miskami v difuzních mikrobiologických zkouškách. Tento plán vyžaduje, aby počty ošetření v jednotlivých blocích (vrzích, Petriho miskách) byly stejné a tak velké, aby jednotlivé bloky mohly zahrnout všechna ošetření. To je ilustrováno v části 5.1.3. Může být použit i znáhodněný plán s opakováním. Algoritmus pro získání náhodných permutací je popsán v části 8.5.

3.2.2.3 Latinské čtverce

Tento plán zkoušky je vhodný, ovlivňují-li odpověď dva různé rušivé vlivy nabývající k různých úrovní. Např. mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik se provádí na destičce rozdělené do k x k polí tak, že každé z k ošetření je právě jednou v každém sloupci a v každém řádku destičky. Tento plán pokusu je použitelný při stejném počtu sloupců, řádků i ošetření. Výsledky jsou zaznamenávány do tabulky k x k, nazývané latinský čtverec. Variabilita odpovědi způsobená rozdíly v poloze ošetření na destičce (mezi k sloupci a k řádky) je rovnoměrně rozdělena a tím je tedy snížena chyba. V části 5.1.2 je uveden příklad latinských čtverců. Algoritmus pro vytvoření latinských čtverců je v části 8.6.

3.2.2.4 Křížová zkouška

Tento plán je užitečný, je-li možné pokus rozdělit do bloků, z nichž každý obsahuje pouze dvě ošetření, např. tvoří-li blok jedna pokusná jednotka ošetřená dvalQát při různých podnětech. Tento plán pokusu sleduje zvýšení přesnosti omezením vlivu rozdílu mezi pokusnými jednotkami tím, že vyvažuje efekt rozdílu odpovědí na oba podněty. Pokus, ve kterém se testují dvě dávky standardu proti dvěma dávkám přípravku, se nazývá dvoudávkový křížoví pokus a podobně pro test se třemi dávkami obou podnětů se používá název třídávkový křížový pokus. Pokus je rozdělen do dvou částí provedených ve vhodných časových intervalech. Pokusné jednotky jsou rozděleny do čtyř (případně šesti) skupin a ošetřeny nejprve jednou ze čtyř (šesti) dávek. Později jsou tytéž jednotky ošetřeny tak, že ty jednotky, které byly ošetřeny menší dávkou, se ošetří dávkou větší a naopak. U jednotlivých pokusných jednotek se též zamění aplikace standardu za přípravek a naopak. Rozložení dávek je zobrazeno v tabulce 3.2.2-I. Příklad použití je možno nalézt v části 5.1.5.

Tab. 3.2.2-I Uspořádání dávek v křížovém pokusu

3.2.3 Analýza rozptylu

V této části jsou uvedeny vzorce, které je potřeba použít při výpočtu analýzy rozptylu. K jejich pochopení pomohou příklady zpracované v části 5.1. K pochopení vzorců slouží i slovníček použitých symbolů (část 9).

Vzorce jsou vhodné pro symetrické zkoušky, ve kterých je porovnáván jeden nebo více zkoušených přípravků (T, U atd.) se standardem (S). Je nutno zdůraznit, že tyto vzorce jsou použitelné pouze při ekvidistantních dávkách podnětů, stejném počtu ošetření pro všechny přípravky a stejném počtu pozorování u všech ošetření.

Bez ohledu na některé úpravy chybového členu je základ analýzy výsledků zkoušek stejný pro plány s úplným znáhodněním, náhodnými bloky a latinskými čtverci. Vzorce pro vyhodnocení křížových pokusů nelze plně schematizovat, analýza jednoho takovéhoto pokusu je obsažena v příkladě 5.1.5.

Vezmou-li se v úvahu body diskutované v části 3.1 a v případě potřeby se transformují odpovědi, mohou se hodnoty y sečíst pro každé ošetření a každý přípravek, jak je to patrné v tabulce 3.2.3-I. Dále by měl být vypočten lineární kontrast odpovidajicí sklonu závislosti odpovědi na logaritmu dávky. V tabulce 3.2.3-II jsou další tři vzorce, potřebné pro výpočet analýzy rozptylu.

Celková variabilita odpovědí, kterou způsobují různá ošetření, se rozkládá na složky uvedené v tabulce 3.2.3-III. Součty čtverců se vypočtou z hodnot v tabulkách 3.2.3-I a 3.2.3-II. Součet čtverců pro test nelinearity je možno počítat pouze, pokud jsou ve zkoušce pro každý přípravek alespoň tři dávky.

Reziduální chyba zkoušky se získá odečtením složek variability tvořených modelem od celkové variability odpovědi (tabulka 3.2.3-N). Symbol y" je používán pro průměrnou odpověď v celé zkoušce. Pro latinské čtverce je počet opakovaných odpovědí (n) stejný jako počet řádků, sloupců a ošetření (dh).

Nyní se dokončí analýza rozptylu. Průměrné čtverce se vypočtou vydělením součtu čtverců jejich stupni volnosti. Tyto čtverce testovaných veličin se vydělí reziduální chybou (s²) a tak získané testovací charakteristiky se porovnají s odpovídajícími hodnotami tabulky 8.1 nebo se použije vhodný počítačový program.

3.2.4 Test validity

Výsledky zkoušky se pokládají za „statisticky validní" při těchto výsledcích:

1. Lineární složka variability (směrnice regresní přímky) je významná, tj. vypočtená pravděpodobnost je menší než 0, 05. Není li tato podmínka splněna, není možno vypočíst 95% meze spolehlivosti.
2. Nerovnoběžnost není statisticky významná, tj. vypočtená pravděpodobnost není menší než 0, 05. To indikuje, že je splněna podmínka 5A části 3.1.
3. Nelineární složky variability nejsou statisticky významné, tj. vypočtená pravděpodobnost není menší než 0, 05. To indikuje, že je splněna podmínka 4A části 3.1.

Statisticky významné odchylky od předpokladu rovnoběžnosti ve vícenásobných zkouškách mohou být způsobeny tím, že je do plánu zkoušky zahrnut přípravek, který má jiný sklon lineární závislosti odpovědi na logaritmu dávky než ostatní zkoušené přípravky. Místo odmítnutí této zkoušky jako chybné se mohou odstranit všechny údaje o tomto přípravku a zopakovat výpočet pro zbylé přípravky.

Pokud se prokáže statistická validita dat, mohou být dále popsaným způsobem vypočteny účinnosti a meze spolehlivosti.

3.2.5 Odhad účinnosti a její meze spolehlivosti

Jestliže je I rozdíl logaritmů sousedních dávek každého přípravku, pak společný sklon (b) všech d-dávkových zkoušek je:

(3.2.5-1)

a logaritmus relativní účinnosti zkoušeného přípravku (např. T) pak je:

(3.2.5-2)

Vypočtená účinnost je odhadem „skutečné účinnosti" zkoušeného přípravku. Interval spolehlivosti (éterý s 95% pravděpodobností obsahuje skutečnou hodnotu účinnosti) se vypočte jako antilogaritmus výrazu:

Hodnoty t je možno získat z tabulky 8.2 pro p = 0, 05 a počet stupňů volnosti rovný stupňům volnosti reziduální chyby. Odhadovanou účinnost (R_T) a jí odpovídající meze spolehlivosti se získají odlogaritmováním získaných hodnot a následným vynásobením hodnotou A_T. Nemají-li základní roztoky přesně danou účinnost podle referenční a předpokládané účinnosti, je nutno použít korekční faktor (viz příklady 5.1.2 a 5.1.3).

Tab. 3.2.3-I Vzorce pro zkoušky model rovnoběžnosti s d dávkami pro každý přípravek

Tab. 3.2.3-II Další vzorce pro výpočet analýzy rozptylu

Tab. 3.23-III Vzorce pro výpočet součtu čtverců a stupňů volnosti

^(*) nelze počítat pro dvoudávkové zkoušky

Tab. 3.2.3-IV Odhad reziduální chyby

^(*) není počítán pro úplně znáhodněný plán

^(**) počítá se pouze pro latinské čtverce

^(***) závisí na typu plánu zkoušky

3.2.6 Chybějící hodnoty

Ve vyvážených zkouškách se může přihodit, že v souvislosti s ošetřením dojde ke ztrátě jedné nebo více odpovědí, např. tak, že některá zvířata uhynou. Pokud lze předpokládat, že selhání nikterak nesouvisejí se složením podávaných přípravků, je možno použít úplnou statistickou analýzu, ale vzorce pro její výpočet jsou mnohem složitější a jsou pouze krátce zmíněny v pasáži o obecném lineárním modelu (viz část 7.1). Nicméně pokud je prokazatelné, že výskyt chybějící hodnoty nijak nesouvisí s přidělením pokusných jednotek do jednotlivých skupin, může být zachována jednoduchost vyhodnocení vyváženého plánu zkoušky tak, že se nahradí chybějící hodnota hodnotou vypočtenou na základě ostatních pozorovaných hodnot. Ztráta informace se pak vezme v úvahu zmenšením počtu stupňů volnosti celkového a součtu čtverců o jeden a použitím vzorce pro výpočet chybějící hodnoty (viz níže). Je třeba si uvědomovat, že tato metoda je pouze přibližná a že by měla být dána přednost přesným metodám.

Pokud chybí více než jedno pozorování, může se použít stejný vzorec. Postup je takový, že se hrubě odhadnou všechny chybějící hodnoty kromě jedné, která se vypočte podle uvedeného vzorce ze všech ostatních hodnot, včetně těch hrubě odhadnutých. Vypočtená hodnota se vezme za pozorovanou a pokračuje se stejným postupem pro všechny další chybějící hodnoty. Po vypočtení všech chybějících hodnot se tímto postupem provede cyklus znovu od začátku, přičemž se místo hrubých odhadů použijí posledně vypočtené hodnoty pro všechny chybějící odpovědi. To vše se opakuje několikrát, až se získají ve dvou po sobě následujících cyklech stejné hodnoty. Konvergence tohoto postupu je obvykle rychlá.

Pokud je počet nahrazovaných hodnot relativně malý v porovnání s celkovým rozsahem zkoušky (menší než 5 %), je použitá aproximace chybějících hodnot a redukce stupňů volnosti o počet chybějících hodnot obvykle uspokojivá. Nicméně výsledky by se měly interpretovat velmi opatrně, obzvláště pokud chybějící hodnoty v některém ošetření nebo bloku převažují. Pak by měl biometr uvážit, zda nepůsobily v průběhu zkoušky nějaké další nežádoucí vlivy. Nahrazení chybějících hodnot ve zkoušce bez jejího opakování je vždy choulostivé.

Úplné znáhodnění

Při úplném znáhodnění se za odhad chybějící hodnoty bere aritmetický průměr všech ostatních odpovědí daného ošetření.

Plán náhodných bloků

Chybějící hodnota ( y' ) se vypočte podle vzorce:

(3.2.6-1)

kde B' je součet odpovědí v bloku obsahujícím příslušné chybějící pozorování, T' je součet odpovědí při příslušném ošetření a G' součet všech odpovědí ve zkoušce.

Latinské čtverce

Chybějící hodnota (y') se nahradí podle vzorce:

(3.2.6-2)

kde B' a C' jsou součty odpovědí v řádce a sloupci s chybějícím pozorováním. V tomto případě je k = n.

Dvoudávková křížová zkouška

Vyskytne-li se chybějící pozorování v dvoudávkové křížové zkoušce, je důležité konzultovat situaci se statistikem, protože vyhodnocení závisí na konkrétní kombinaci ošetření.

3.3 Model poměru sklonů

3.3.1 Úvod

Tento model je vhodný např. pro některé mikrobiologické zkoušky, v nichž je nezávisle proměnnou koncentrace růstového faktoru půdy. Model poměru sklonů, graficky zobrazen na obrázku 3.3.1-I.

nbsp;

Obr. 3.3.1-I Model poměru sklonů zkoušky 2 x 3 + 1

Dávka s nulovou koncentrací je na vodorovné ose zobrazena vlevo a dávky s nejvyššími koncentracemi vpravo. Odpověd' je zobrazena na vertikální ose. Odpovědi na tyto dávky jsou v grafu zobrazeny pomocí černých bodů. Dvě zobrazené přímky představují vypočtenou lineární závislost referenčního a zkoušeného přípravku na dávce za předpokladu, že se protínají v nulové dávce. Na rozdíl od modelu rovnoběžnosti nejsou dávky transformovány logaritmem.

Stejně jako ve zkouškách založených na modelu rovnoběžnosti má být předpokládaná účinnost blízká skutečné hodnotě účinnosti a mají být použita (pokud je to možné) stejně účinná ředění zkoušeného a referenčního přípravku. Čím blíže je předpokládaná účinnost skutečné hodnotě, tím blíže budou i obé přímky. Poměr sklonů představuje „skutečnou" účinnost zkoušeného přípravku vztaženou k předpokládané účinnosti. Je-li sklon zkoušeného přípravku strmější než sklon standardu, je účinnost podhodnocena a výpočet naznačuje, že odhadovaná účinnost je větší než předpokládaná. Podobně, pokud je sklon zkoušeného přípravku mírnější než sklon standardu, je účinnost nadhodnocena a výpočet naznačuje, že odhadovaná účinnost je menší než předpokládaná.

Při přípravě zkoušky by mělo být ověřeno, zda všechny odpovědi splňují podmínky 1, 2 a 3 z části 3.1. V rámci rutinního zpracování analýzy rozptylu, které je popsáno v části 3.3.3, by mělo být ověřeno splnění podmínek 4B a 5B.

3.3.2 Plán zkoušky

Pro použití dále popsaných statistických metod je nutno klást na zkoušku následující omezení:

1. pro zkoušený a referenční přípravek musí být použit stejný počet ekvidistantních ředění,
2. je možno testovat i zvláštní skupinu pokusných jednotek, které nemají žádné ošetření (nulová dávka),
3. pro každé ošetření musí být použit stejný počet pokusných jednotek.

Jak již bylo konstatováno v části 3.1.3, nemusí pokusné plány splňovat tato omezení, pak ale nejsou použitelné zde popsané jednoduché metody statistické analýzy a je nutno vyhledat radu experta nebo použít vhodný program.

Obvykle bývá dána přednost plánu s dvěma dávkami pro přípravek a se společnou nulovou dávkou (plán (2h + 1)), protože poskytuje vysokou přesnost a možnost ověřit platnost ry"še zmíněných podmínek. Ne vždy je ale možno předpokládat linearitu až k nulové koncentraci. S malou ztrátou přesnosti je možno použít i plán bez nulové dávky. Pak je ale dávána přednost plánu se třemi dávkami na přípravek „plán (3h)" před dvoudávkovým plánem. Dávky jsou tedy vytvářeny takto:

1. standard je použit v nejvyšší dávce blízké ale nepřesahující oblast, kde je závislost odpovědi na dávce ještě lineární,
2. další dávky jsou rovnoměrně rozloženy mezi touto hodnotou a nulovou dávkou,
3. pro zkoušený přípravek jsou použity dávky založené na předpokládané účinnosti materiálu.

Podobně jako v části 3.2.2. je možno použít plány s úplným znáhodněním, náhodnými bloky nebo latinskými čtverci. Použití kteréhokoliv z těchto plánů vyžaduje podobnou úpravu postupu pro odhad reziduálního součtu čtverců jako u modelu rovnoběžnosti. Dále je popsána analýza zkoušky jednoho nebo více neznámých přípravků v porovnání se standardem.

3.3.3 Analýza rozptylu

3.3.3.1 Plán (hd + 1)

Nejprve je nutno ověřit odpovědi, jak je to popsáno v části 3.1, a pokud je to nutné, vhodně je transformovat. Dále se vypočtou průměrné odpovědi pro jednotlivé dávky a přípravky, jako je uvedeno v tabulce 3.3.3.1-I, a průměrná odpověd' na nulovou dávku (B).

Podle tabulek 3.3.3.1-I až 3.3.3.1-III se pro analýzu rozptylu vypočte součet čtverců. Součet čtverců pro test nelinearity je možno vypočíst pouze pokud zkouška obsahuje alespoň tři dávky pro každý přípravek. Reziduální chyba se získá odečtením zdrojů variability příslušného plánu od celkové variability (viz 3.3.3.1-IV).

Analýza rozptylu se dokončí vydělením příslušných součtů čtverců jejich stupni volnosti, čímž se získají průměrné čtverce. Ty se pak vydělí reziduálním rozptylem (s²). Získané hodnoty testovací statistiky F se porovnají s kritickými hodnotami z tabulky 8.1 nebo vhodným počítačovým programem.

3.3.3.2 Plán (hd)

Vzorce jsou až na drobné rozdíly stejné jako v případě plánu (hd + 1).

• Veličina B se ve vzorcích nevyskytuje.

• K =	n(Ps + PT + ...)2
  	hd

• SS_nul není obsažena ve vzorcích pro analýzu rozptylu.
• Počet stupňů volnosti pro ošetření je hd - 1.
• Počet stupňů volnosti reziduální chyby a celkový rozptyl je počítán stejně jako v modelu rovnoběžnosti (viz tabulka 3.2.3-IV).

Validita zkoušky, účinnost a interval spolehlivosti jsou popsány v části 3.3.4 a 3.3.5.

3.3.4 Test validity

Zkouška je „statisticky validní", pokud jsou získány následující výsledky analýzy rozptylu:

1. kontrast nulové dávky zkoušky s plánem (2h + 1) nesmí být statisticky významný, tj. vypočtená pravděpodobnost nesmí být menší než 0, 05. To indikuje, že odpověd' na nulovou dávku se statisticky významně neliší od společného průsečíku přímek a předpoklad lineární závislosti platí až do nuly,
2. kontrast průsečíků není statisticky významný, tj. vypočtená pravděpodobnost nesmí být menší než 0, 05. To naznačuje splnění podmínky 5B z části 3.1,
3. ve zkouškách s alespoň třemi dávkami na pripravek není statisticky významný kontrast nelinearity, tj. vypočtená pravděpodobnost nesmí být menší než 0, 05. To indikuje splnění podmínky 5B z části 3.1.

Statisticky významný kontrast nulové dávky indikuje, že hypotéza linearity neplatí v okolí nuly. Pokud je pro tento typ zkoušky takovýto výsledek spíše systematický než výjimečný, je vhodnější použití (hd) plánu. V tomto případě nemusí být požadována odpověd' na nulovou dávku.

Prokáží-li prislušné testy validitu zkoušky, může být vypočtena účinnost a její meze spolehlivosti postupem popsaným v části 3.3.5.

Tab. 3.3.3.1-I Vzorce pro model sklonů pro plán (2h + 1)

^* Nelze počítat pro dvoudávkové zkoušky

Tab. 3.3.3.1-II Další vzorce pro výpočet analýzy rozptylu

Tab. 3.3.3.1-III Vzorce pro výpočet součtů čtverců a stupně volnosti

^(*) Nelze počítat pro dvoudávkové zkoušky

Tab. 3.3.3.1-IV Odhad reziduální chyby

3.3.5 Odhad účinnosti a její meze spolehlivosti

3.3.5.1 Plán (hd + 1)

Společný průsečík a'se vypočítá podle vzorce:

-

a, (2d + 1)B + (2d 3)ha (3.3.5.1-1)

-

h(2d - 3) + 2d + 1

Sklon pro standard (podobně i pro ostatní pripravky):

s (3.3.5.1-2)

2d'+3dx+d

Relativní účinnost každého přípravku se pak vypočte jako podíl:

R. b'

r

- (3.3.5.1-3)

r_b'

s

Vynásobením relativní účinnosti RT očekávanou účinností AT se dostane odhadovaná účinnost Rr(=R;. Ar). Jsou-li rozdíly mezi sousedními dávkami referenčního přípravku (IS) a zkoušeného přípravku (IT) různé, je nutno účinnost Rr vynásobit podílem IS ~Ir. Na rozdíl od modelu rovnoběžnosti se pň výpočtech v modelu sklonu nepoužívá antilogaritmus.

Interval spolehlivosti pro R ;. se vypočítá:

5275

CR;.-K't (C-1)(CRíz+1)+K'(K'-2CR;.), (3.3.5.1-4) z

s i

Y, a Y~ jsou čísla vztahující se k rozptylu a kovarianci čitatele a jmenovatele RŤ .

_ 6 1 3

Y` n(2d+1)(d(d+l)+2(2d+1)+hd(d-1))

(3.3.5.1-5)

3d (d +1)

Yz (3d + 1)(d + 2) + hd (d -1)

(3.3.5.1-6)

Meze spolehlivosti se vynásobí faktorem Ar a pokud je to třeba i IS/IT.

3.3.5.2 Plán (hd)

Vzorce jsou stejné jako v plánu (hd+ 1) pouze s následující modifikací: a =a

(3.3.5.2-1)

(3.3.5.2-2)

_ 3(d + 1)

Yz 3(d+1)+h(d-1)

(3.3.5.2-3)

4 Kvantálnf zkoušky

4.1 Úvod

V některých zkouškách je nemožné nebo extrémně náročné měřit působení přípravku na každou pokusnou jednotku na stupnici. Místo toho je pozorován nějaký efekt působení přípravku na pokusné jednotky, jako např. uhynutí nebo hypoglykemický symptom pokusných jednotek. Výsledek pak závisí na počtu jednotek, u kterých se projeví tento efekt. Takové zkoušky se nazývají kvantální nebo „vše nebo nic".

Situace je velmi podobná kvantitativní zkoušce popsané v části 3.1, ale místo n riizných odpovědí v každé ošetřené skupině se získá pouze jediná hodnota, tj. procento jednotek s pozitivní odpovědí. Grafem závislosti tohoto procenta na logaritmu dávky je zpravidla spíše křivka tvaru S než přímka. K odhadu křivky závislosti odpovědi na dávce se používají matematické funkce modelující tuto závislost tvaru S. Nejčastěji je používána kumulativní distribuční funkce normálního rodělení. Tato funkce má několik teoretických výhod a je snad nejlepší volbou, pokud je odpověd' zatížena chybou pokusných jednotek. Pokud odpověd' více závisí na růstovém procesu, je vhodnější použití logistické regrese. Rozdíl výsledků obou modelů je ale obvykle velmi malý.

Maximálně věrohodný odhad sklonu a polohy těchto křivek je možno získat pouze iteračními metodami. Je mnoho postupů k dosažení stejných výsledků, ty se ale liší svou efektivitou z pohledu rychlosti konvergence. Jedna z nejrychlejších metod je přímá maximalizace věrohodnostní funkce (viz část 7.1). Ta se dá snadno implementovat do počítačových programů jako standardní postup. Většina z těchto postupů však neposkytuje odhady intervalů spolehlivosti a metody jejich výpočtu jsou na tento text velmi složité. Dále popsaná metoda není nejrychlejší, ale je zvolena jako alternativa pro svoji jednoduchost. Může se použít při provádění zkoušek, ve kterých se porovnává jeden nebo více přípravků se standardem. Musí být ale navíc splněny následující požadavky:

5276

1) závislost odpovědi na logaritmu dávky má tvar, ktery" je možno popsat pomocí kumulativní distribuční funkce normálního rozdělení,

2) křivky standardu a zkoušeného přípravku jsou rovnoběžné, tj. mají stejný tvar a liší se pouze posunutím,

3) teoreticky na extrémně nízkou dávku je odpověd' negativní a na extrémně vysokou je naopak vždy pozitivní odpověď.

4.2 Probitová metoda

Funkci tvaru S lze převést na lineární tvar, pokud se nahradí odpovědi (tj. podíl pozitivních odpovědí ve skupině) odpovídající hodnotou kumulativní distribuční funkce standardního normálního rozdělení. Tato hodnota se obvykle nazývá „normu" a nabývá hodnot od - ~ do ~ . Dříve bylo doporučováno přičíst 5 a tato získaná hodnota byla nazývána „probit". Tato úprava zjednodušila ruční provádění výpočtů tím, že se vyhnula záporným hodnotám. S rozvojem výpočetní techniky ztratila tato potřeba přičítat k normitům 5 praktický význam. Pro dále popsanou metodu tedy bude vhodnější používat název „normitová metoda". Pojem probitová analýza je široce rozšířen, a proto se v této stati z historických důvodů tento název používá.

Po linearizaci odpovědí by se mohlo k hodnocení použít metody pro model rovnoběžného sklonu, popsané v části 3.2. Není však splněn požadavek na homogenitu rozptylů pro každou dávku. Rozptyl je minimální pro normu = 0 a zvětšuje se vzdalováním normitu od nuly na obě strany. Proto je nutno použít pro odpovědi v prostřední části větší váhy a nižší váhy pro okrajové části číselné osy normitů. Dále je popsána takováto metoda analýzy rozptylu, odhadu účinnosti

a intervalů spolehlivosti.

Tab. 4.2.1-I První pracovní tabulka

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15)

Dávka n r x p Y cb Z y w wx wy wxZ wyZ wxz

S

T

atd.

Tab. 4.2.1-II Druhá pracovní tabulka

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12)

~w ~wx ~wy Ewx' ~, y, 2 Ewxy S~ Sem, S», ž Ý a

S

T

atd.

4.2.1 Zapisování výsledků

Tabulka 4.2.1-I se používá pro zápis dat do sloupců označených čísly. (1) Dávka standardu nebo zkoušeného přípravku.

(2) Počet vyšetřených jednotek n pro příslušné ošetření.

(3} Počet jednotek r, které měly pozitivní odpověď na toto ošetření. (4) Logaritmus x dávky.

5277

(5) Podíl p = r pozitivních odpovědí ve skupině. n

Zde začíná iterační cyklus.

(fi) Sloupec Y je při prvním iteračním kroku vyplněn nulami. normálního rozložení (viz tabulka 8.4).

(7) Odpovídající hodnoty 4> _ ~(Y) kumulativní distribuční funkce

Pro výpočet sloupců (8) až (10) jsou použity vzorce:

e-r'Iz

(8) Z = (4.2.1-1)

2n

(9) Y-_Y+P_~ (4.2.1-2)

Z

(10) w= ~ Z~z (4.2.1-3)

Sloupce (11) až (15) se jednoduše vypočtou ze sloupců (4), (9) a (10) jako wx, wy, wx2, wy2 a wxy. Dále se vypočtou pro každý přípravek zvlášť součty ~ sloupců (10) až (15).

Součty z tabulky 4.2.1-I se přepíší do sloupců (1) až (6) tabulky 4.2.1-II. a 6 dalších sloupců (7) až (12) se vypočte pomocí vzorců:

wx) x

(7) S~=~wzz (4.2.1-4)

w

~ ~~

(8) Sem, _ ~ wxy - ~~ (4.2.1-5)

~)z

(9) Svr=~wyz_ (4.2.1-6)

~w

wx (4.2.1-7)

(10)x=

w

(11)1'= (4.2.1-8)

w

Společný sklon b se pak vypočte jako:

Sem,

b=~ (4.2.1-9)

S~

a průsečík a přímek pro referenční a zkoušený přípravek je

(12)a=Ý-bž (4.1.2-10)

5278

Sloupec (6) první pracovní tabulky se ted' může nahradit hodnotami Y = a + bx a cyklus tak dlouho opakovat, dokud nebude rozdíl dvou po sobě následujících cyklů dostatečně malý, tj. např. pokud maximální rozdíl Y ve dvou po sobě následujících cyklech nebude menší než 10~.

4.2.2 Testy validity

Před výpočtem účinností a jejich intervalů spolehlivosti je třeba ověřit validitu, tj. linearitu závislosti transformované veličiny y (4.2.1-2) na logaritmu dávky x a rovnoběžnost přímek vyjadřujících tento vztah pro všechny přípravky. Odchylka od linearity pro všechny přípravky podané nejméně ve třech dávkách se vypočte takto: Do tabulky 4.2.1-II se připojí sloupec číslo (13) obsahující hodnoty veličiny:

(4.2.2-1)

Součet hodnot ve třináctém sloupci Xt a je mírou odchylky od linearity. Zkoušku je třeba zamítnout, když 7!y z překročí na hladině významnosti 0, 05 kritickou hodnotu xz rozdělení s (N - 2h) stupni volnosti. Tato kritická hodnota se najde v tabulce 8.3 nebo se vypočte pomocí vhodného počítačového programu. N je počet všech podaných dávek a h je počet všech přípravků zahrnutých do zkous'ky. Je-li hodnota významná na hladině významnosti 0, 05 je nutno zkoušku zamítnout (viz část 4.2.4).

Pokud výše zmíněný test neindikuje významnou odchylku od linearity, je třeba dále na hladině významnosti 0, 05 otestovat rovnoběžnost. K tomu se použijí kritéria X~z s h -1 stupni volnosti:

z k

S~ ~S~l (4.2.2-2} xR -

_

(součet E se provede přes všechny přípravky).

Když hodnota ~' překročí příslušnou kritickou hodnotu rozdělení 7(, 2, pokládá se odchylka od rovnoběžnosti za statisticky významnou. Pokud odchylky od linearity a rovnoběžnosti nejsou statisricky významné, je zkouška validní.

4.2.3 Odhad účinnosti a její meze spolehlivosti

Pokud nebyly nalezeny žádné odchylky od předpokladu linearity a rovnoběžnosti, je možno vypočítat logaritmus relativní účinnosti:

M. _ ar _ as r

b

(4.2.3-1)

a dále tento výraz odlogaritmovat. Dále se položí t = 1, 96 a s = 1. Meze spolehlivosti se pak získají odlogaritmováním výrazu:

CMŤ-(C-1)(žs-xr)t (C-1)V~S~+C(M;.-žs+žr)zl , (4.2.3-2)

kde

C bz~S~-sztz

a

V= 1 + 1 ~w ~w s r

5279

4.2.4 Chybné zkoušky

Je-li test odchylky od linearity, viz část 4.2.2, statisticky významný, měla by se příslušná zkouška zamítnout jako nevyhovující. Někdy může být důvod předpokládat, že k této odchylce přispívají další v průběhu zkoušky nekontrolovatelné nebo nekontrolované vlivy. Pak je možné zkoušku zachovat s mírnou modifikací hodnocení jejích výsledků. Za t se položí kritická hodnota t-rozdělení (p = 0, 05) se stejným počtem stupňů volnosti jako v testu linearity (N- 2h) a s se změní tak, že je:

z

s z - pit (N - 2h)

(tato hodnota bude obvykle větší než 1).

Testové kritérium pro test rovnoběžnosti je pak podíl

F -_ (h _ 1)sx ,

který má F rozdělení s h - 1 a N- 2h stupni volnosti. Statistická významnost podílu F se otestuje na hladině význam

nosti 0, 05.

4.3 Logitová metoda

Jak již bylo řečeno v části 4.1, je někdy vhodnější použít logitovou metodu. Jméno je odvozeno od logitové funkce, která je inverzní k logistickému rozložení. Postup odhadu je podobný, jako byl popsán u probitové metody, pouze s následující modifikací funkcí ~ a Z

_ Z

1 (4.3-1)

1 + e_r

e-r

~1+e-r) z (4.3-2)

4.4 Jiné tvary křivek

Probitová a logitová metoda prakticky vždy postačují pro analýzu kvantálních dat požadovanou v lékopise. Nicméně pokud je zřejmé, že závislost odpovědi na logaritmu dávky má jiný tvar než zmíněné křivky, je možno změnit tvar funkcí cp a Z. Funkce Z je první derivací funkce cp . Např. pokud je prokazatelné, že funkce není symetrická, může být vhodným modelem Gompertzovo rozdělení (metoda gompit); v tom případě je ~ =1- e-`` a Z = er-`` .

4.5 Medián efektivnf dávky

U některých typů zkoušek je požadováno získání odhadu mediánu efektivní dávky, což je dávka, na kterou odpoví 50 % jednotek. Probitovou metodu je možno použít i pro stanovení mediánu efektivní dávky (EDsa), ale protože není potřeba tuto dávku vyjádřit relativně vzhledem ke standardu, jsou příslušné vzorce mírně odlišné.

Poznámka: Standard by měl být do zkoušky nezávazně též zahrnut, aby bylo možno ověřit validitu zkoušky. Obvykle se zkouška považuje za validní, pokud je vypočtená hodnota ED~ standardu dostatečně blízko jeho předpokládané hodnotě. Co to znamená „dostatečně blízko", závisí na požadavcích uvedených v jednotlivých článcích.

Tabulky pro odpovědi zkoušeného vzorku a nezávazně i standardu jsou v části 4.2.1. Test linearity je popsán v části 4.2.2. Test rovnoběžnosti není pro tento typ zkoušky nutný. Odhad ED~ zkoušeného přípravku T, podobně i pro ostatní přípravky, se získá podle popisu v části 4.2.3, ale s následující modifikací vzorců 4.2.3-1 a 4.2.3-2:

5280

Mr = brT (4.5-1)

a

CM~.-(C-1)žr± (C-1)V~S~+C(M~.-xr)z (4.5-2)

kde Y = ~ a C zůstane nezměněné. w

r

5 Příklady

Tato část ilustruje použití výše popsaných vzorců a postupů na pracovních pří3dadech, které byly vybrány především pro ilustraci statistických metod a výpočtů. Nejsou zamýšleny jako příklad vhodných metod zkoušek, pokud jsou ve speciální části povoleny i jiné metody. Ke zvýšení jejich užitečnosti pro kontrolu přesnosti výpočtů je použit větší počet desetinných míst, než je nezbytné pro hodnocení výsledků zkoušek. Je nutno poznamenat, že existuji i jiné ekvivalentní metody výpočtu. Tyto metody by měly vést k úplně stejným výsledkům jako zde publikované metody.

5.1 Model rovnoběžnosti

5.1.1 Dvoudávková vícenásobná zkouška úplně znáhodněná

Stanovení účinnosti kortikotropinu podkožním podáním potkanům

Standard se podával v dávkách 0, 25 a 1, 0 jednotek na 100 g tělesné hmotnosti. Testovaly se dva přípravky, oba o předpokládané účinnosti 1 jednotka na miligram. Přípravky se tedy podávaly ve stejných dávkách jako standard. Jednotlivé odpovědi a jejich průměry jsou v tabulce 5.1.1-I. Grafická prezentace nevzbuzuje žádné pochybnosti o homogenitě rozptylů a normalitě dat, ale otvírá otázku o platnosti předpokladu rovnoběžnosti u přípravku U.

Tab. 5.1.1-I Odpovědi y množství kyseliny askorbové (mg) ve 100 g nadledvin

Standard S Přípravek T Pripravek U

S, SZ T1 Tz U, UZ

300 289 310 230 250 236

310 221 290 210 268 213

330 267 360 280 273 283

290 236 341 261 240 269

364 250 321 241 307 251

328 231 370 290 270 294

390 229 303 223 317 223

360 269 334 254 312 250

342 233 295 216 320 216

306 259 315 235 265 265

průměr ~ 332, 0 ~ 248, 4 323, 9 244, 0 282, 2 250, 0

5281

Obr. 5.1.1-I

Vzorce v tabulce 3.2.3-I a 3.2.3-II vedou k hodnotám: PS = 580, 4 LS = -41, 8

PT = 567, 9 LT = -39, 95

PU = 532, 2 L„ _ -16, 1

10 120

HP=2--5 HL= 6 =20

Analýza rozptylu se dokončí za pomoci vzorců z tabulek 3.2.3-III a 3.2.3-N, viz tabulka 5.1.1-II. Tab. 5.1.1-II Analýza rozptylu

Zdroj variability Stupně volnosti Součet čtverců Průměrný čtverec F-statistika Pravděpodobnost

přípravek 2 6256, 6 3128, 3

regrese 1 63 830, 8 63 830, 8 83, 38 0, 000

nerovnoběžnost 2 8218, 2 4109, 1 5, 37 0, 007

ošetření 5 78 305, 7

reziduální chyba 54 41 340, 9 765, 57

celkem 59 119 646, 6

Analýza potvrdila silnou lineární závislost. Odchylka od předpokladu rovnoběžnosti je také silně významná (p = 0, 0075). To se dalo očekávat již z grafické prezentace, kde závislost na dávce není u přípravku U paralehú se závislostí na standardu. Tento přípravek se tedy z analýzy vyloučí a výpočet se zopakuje pouze pro přípravek T a standard S.

Tab. 5.1.1-III Analýza rozptylu bez přípravku U

Zdroj variability Stupně volnosti Součet čtverců Průměrný čtverec F-statistika Pravděpodobnost

přípravek 1 390, 6 390, 6

regrese 1 66 830, 6 66 830, 6 90, 5 0, 000

nerovnoběžnost 1 34, 2 34, 2 0, 05 0, 831

ošetření 3 67 255, 5

reziduální chyba 36 26 587, 3 738, 54 - .

celkem 39 93 842, 8

5282

Výsledky analýzy bez přípravku U jsou v souladu s požadavky linearity a rovnoběžnosti, může se tedy přistoupit k výpočtu účinnosti. Vzorce z části 3.2.5 dají následující výsledky:

Pro společný sklon

b - 20 x (-41, 8 - 39, 95) _ -58, 970 1n4x10x2

logaritmus relativní účinnosti

M, __ 567, 9-580, 4 =01060 r 2 x (-58, 970)

_ 66 830, 6 _

C 66 830, 6 - 738, 54 x 2, 0282 -1, 0476

_ 66 830, 6 _

V (-58, 970)2 x 2 x 10 - 0'9609

a logaritmus mezí spolehlivosti

1, 0476 x 0, 1060± 0, 0476 x (1, 0476 x 0, 10602 + 2 x 0, 9609) = 0, 1110 1 0, 3034

Po odlogaritmování se získá relativní účinnost 1, 11 s 95% intervalem spolehlivosti od 0, 82 do 1, 51.

Po vynásobení předpokládanou účinností přípravku T se získá účinnost 1, 11 jednotky/mg s mezemi spolehlivosti od 0, 82 do 1, 51 jednotek/mg.

5.1.2 Třídávková zkouška s latinskými čtverci

Stanovení účinnosti antibiotik difuzní metodou v pravoúhlých plotnách

Použitý standard má předpokládanou účinnost 4855 m j./mg, zkoušený přípravek má stanovenou účinnost 5600 m.j./mg. Jako základní ředění bylo rozpuštěno 25, 2 mg standardu v 24, 5 ml rozpouštědla a 21, 4 mg zkoušeného přípravku v 23, 95 ml rozpouštědla. Tento základní roztok byl u obou přípravků ředěn 1 : 20 a dále byl použit ředící poměr 1, 5.

Latinské čtverce byly vytvořeny metodou popsanou v části 8.6, viz. tabulka 5.1.2-I. Odpovědi (inhibiční zóny jsou v mm x 10) jsou uvedeny v tabulce 5.1.2-II. Průměry pro jednotlivá ošetření jsou v tabulce 5.1.2-III. Graficky jsou data zobrazena na obrázku 5.1.2-I, který nezadává důvod pochybovat o splnění požadavků normality a homogenity rozptylů.

Tab. 5.1.2-I Rozložení ošetření na plotně

1 2 3 4 5 6

S, T, TZ S, SZ T3

T, T, S, SZ TZ S,

TZ S, SZ S, T, T,

S, SZ T, T, S, TZ

SZ TZ S, T, T, S,

Ts S' TZ - ~. SZ

S3

5283

Tab. 5.1.2-II Změřené inhibiční zóny v mm x 10

1 2 3 4 5 6 průměry 172, 8 179, 7 177, 2 sloupců = C, = C = C3

1 2 3 4 5 6 průměry řádků 175, 2 = R, 171, 2 = Rz 172, 7 = R3 178, 5 = Ra 177, 5 = Rs 181, 0 = R6

161 160 178 187 171 194

151 192 150 172 170 192

162 195 174 161 193 151

194 184 199 160 163 171

176 181 201 202 154 151

193 ~ 166 T 161 186 198 182

178, 0 174, 8 173, 5 Ca = Cs = Ce

Tab.5.1.2-III Průměry

Standard S Přípravek T

S, SZ S, T, TZ T3

průměr ~ 158, 67 ~ 176, 50 ~ 194, 50 ~ 156, 17 ~ 174, 67 195, 50

Obr. 5.1.2-I

Dosazením do vzorců v tabulkách 3.2.3-I a 3.2.3-II se získá:

PS = 529, 667 LS = 35, 833

Pr = 526, 333 Lr = 39, 333

HP=3=2 6 HL=24=3 72

Pomocí vzorců z tabulek 3.2.3-III a 3.2.3-IV se dokončí výpočet analýzy rozptylu. Výsledky jsou v tabulce 5.2.1-IV.

5284

Tab. 5.1.2-IV

Zdroj variability Stupně volnosti Součet čtverců Průměrný čtverec F-statistika Pravděpodobnost

přípravek 1 11, 1111 11, 1111

regrese 1 8475, 0417 8475, 0417 408, 1 0, 000

nerovnoběžnost 1 18, 3750 18, 3750 0, 885 0, 358

nelinearita 2 5, 4722 2, 7361 0, 132 0, 877

ošetření 5 8510

řádky 5 412 82, 40 3, 968 0, 012

sloupce 5 218, 6667 43, 73 2, 106 0, 107

reziduální chyba 20 415, 3333 20, 7667

celkem I 3 9556

Výsledky této analýzy ukazují, že jsou statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými řádky. To poukazuje na zpřesnění výsledků zkoušky při použití latinských čtverců oproti úplnému znáhodnění plánu zkoušky. Vysoká významnost závislosti na dávce a nevýznamnost odchylky od předpokladu linearity a rovnoběžnosti potvrzují, že je možné pro zkoušku vypočítat účinnost.

Dosazením do vzorců části 3.2.5 se získá: společný sklon

b - 3 x (35, 833 + 39, 333) = 46 346 > >

ln(1, 5) x 6 x 2

logaritmus relativní účinnosti

M, __ 526, 333 - 529, 667 - -0023974 r 3 x 46, 346 '

C - 8475, 0417 -1, 0108 , 8475, 0417 - 20, 7667 x 2, 0862

v - 8475, 0417 = 02192 46, 3462 x 3 x 6

a logaritmus mezí spolehlivosti je:

1, 0108 x (-0, 0240) f 0, 0108 x (1, 0108 x (-0, 0240)2 + 2 x 0, 2192 ) _ -0, 02423 1 0, 06878 .

Odlogaritmováním se získá relativní účinnost 0, 9763 s 95% mezemi spolehlivosti od 0, 9112 do 1, 0456.

Je nutno použít korekční faktor 4855 x 25, 2/24, 5 - 099799, protože ředění nejsou z pohledu předpokládané účinnos5600 x 21, 4/23, 95

nosti zcela ekvivalentní. Vynásobením korekčním faktorem a předpokládanou účinností 5600 m.j./mg se získá účinnost zkoušeného přípravku 5456 m j./mg s 95% intervalem spolehlivosti od 5092 do 5843 m.j./mg.

5.1.3 Čtyřdávková zkouška s náhodnými bloky

Stanovení účinnosti antibiotik turbidimetrickou metodou

Tato zkouška je navržena pro zjištění účinnosti v mezinárodních jednotkách na lahvičku. Standard má stanovenou účinnost m j./mg. Zkoušený přípravek má předpokládanou účinnost 20 000 m j./lahvičku. Na základě těchto informací bylo následujícím způsobem připraveno základní ředění. 16, 7 mg standardu bylo rozpuštěno v 25 ml rozpouštědla a obsah jedné lahvičky zkoušeného přípravku ve 40 nil rozpouštědla. Konečné ředění bylo připraveno nejprve zředěním

5285

1 : 40 a dále použitím ředícího faktoru 1, 5. Zkumavky byly umístěny do vodní lázně v uspořádání do náhodných bloků, viz část 8.5. Odpovědi (absorbance) jsou uvedeny v tabulce 5.1.3-I.

Pohled na obrázek 5.1.3-I nedává důvod pochybovat o platnosti předpokladů normality a homogenity rozptylů zobrazených dat. Směrodatná odchylka S3 je poněkud vyšší, ale není důvod ke zvýšení pozornosti.

Tab. 5.1.3-I Absorbance suspenze (x1000)

Standard S Přípravek T

blok S~ SZ S3 S4 Tl TZ T3 T4 Průměr

1 252 207 168 113 242 206 146 115 181, 1

2 249 201 187 107 236 197 153 102 179, 0

3 247 193 162 111 246 197 148 104 176, 0

4 250 207 155 108 231 191 159 106 175, 9

5 235 207 140 98 232 186 146 95 167, 4

průměr ~ 246, 6 ~ 203, 0 ~ 162, 4 ~ 107, 4 ~ 237, 4 ~ 195, 4 150, 4 ~ 104, 4

zas +

m 0

xso +

z2s +

200 +

125 +

100 +

TS +

50

S1 S2 S3 S4 Tl T2 T3 T4

Obr. 5.13-I

Použitím vzorců z tabulky 3.2.3-I a 3.2.3-II se získá: PS = 719, 4 LS = -229, 1

Pr = 687, 6 Lr = -222

5 60

Hp = 4 =1, 25 Hc - 60 1

Analýza rozptylu je vypočtena pomocí vzorců z tabulek 3.2.3-III a 3.2.3-IV. Výsledky jsou v tabulce 5.1.3-II.

Tab. 5.1.3-II Analýza rozptylu

Zdroj variability Stupně volnosti Součet čtverců Průměrný čtverec F-statistika Pravděpodobnost

přípravek 1 623, 025 623, 025

regrese 1 101 745, 6 101 745, 6 1887, 1 0, 000

nerovnoběžnost 1 25, 205 25, 205 0, 467 0, 500

nelinearita 4 259, 14 64, 785 1, 202 0, 332

ošetření 7 102 662

bloky 4 876, 75 219, 188 4, 065 0, 010

reziduální chyba 28 1509, 65 53, 916

celkem 39 105 048, 4

5286

Rozdíl mezi bloky je statisticky významný a to indikuje, že použití náhodných bloků pro plán zkoušky zvýšilo přesnost prováděné zkoušky. Vysoká významnost závislosti na dávce a nevýznamnost odchylky od předpokladu linearity a rovnoběžnosti potvrzují, že je možno pro zkoušku vypočíst účinnost.

Dosazením do vzorců části 3.2.5 se získá: společný sklon

b - 1 x (-229, 1- 222) _ _ 111, 255 ,

ln(1, 5) x 5 x 2

logaritmus účinnosti

AI, __ 687, 6 - 719, 4 - 0071457 4 x (-111, 255) '

_ 101745, 6 _

C 101745, 6 - 53, 916 x 2, 0482 -1'00223

_ 101745, 6 _

V (-111, 255)2 x 4 x $ - 0'4110

a logaritmus mezí spolehlivosti je:

1, 00223 x 0, 0715 1 0, 00223 x (1, 00223 x 0, 07152 + 2 x 0, 4110) = 0, 07162 1 0, 04293.

Odlogaritmováním se získá relativní účinnost 1, 0741 s 95% mezemi spolehlivosti od 1, 0291 do 1, 1214.

Je nutno použít korekční faktor 670 x 16, 7/25 = 089512 , protože ředění nejsou z pohledu předpokládané účinnosti 20 000 x 1/40

zcela ekvivalentní. Vynásobením korekčním faktorem a předpokládanou účinností 20 000 m j./lahvičku se získá účinnost zkoušeného přípravku 19 228 m j./lahvičku s 95% intervalem spolehlivosti od 18 423 do 20 075 m.j./lahvičku.

5.1.4 Pětidávková vícenásobná zkouška s úplně znáhodněným plánem

Zkouška in vitro tři vakcín hepatitidy B v porovnání se standardem

Pro standard a každou vakcínu byly připraveny tři dvojité řady ředění v pěti různých koncentracích. Po několika dalších krocích byla změřena jejich odpověd' (absorbance), viz tabulka 5.1.4-I.

Tabulka 5.1.4-I

Redění Standard S Přípravek T Přípravek U Přípravek V

1 :16 000 0, 043 0, 045 0, 051 0, 097 0, 097 0, 094 0, 086 0, 071 0, 073 0, 082 0, 082 0, 086

1 : 8000 0, 093 0, 099 0, 082 0, 167 0, 157 0, 178 0, 127 0, 146 0, 133 0, 145 0, 144 0, 173

1:4000 0, 159 0, 154 0, 166 0, 327 0, 355 0, 345 0, 277 0, 268 0, 269 0, 318 0, 306 0, 316

1:2000 0, 283 0, 295 0, 362 0, 501 0, 665 0, 576 0, 586 0, 489 0, 546 0, 552 0, 551 0, 624

1:1000 0, 514 0, 531 0, 545 1, 140 1, 386 1, 051 0, 957 0, 866 1, 045 1, 037 1 1, 039 ~ 1, 068

5287

Obr. 5.1.4-I

O logaritmu optické denzity je známo, že lineárně závisí na logaritmu dávky. Průměrné odpovědi logaritmu optické denzity na jednotlivé dávky jsou v tabulce 5.1.4-II. Na grafickém zobrazení nejsou patrny žádné anomálie.

Tabulka 5.1.4: II

S, -3, 075 T, -2, 344

SZ -2, 396 TZ -1, 789

S3 -1, 835 T3 -1, 073

Sa -1, 166 Ta -0, 550

SS -0, 635 TS 0, 169

U, -2, 572 V, -2, 485

U2 -2, 002 Vi -1, 874

U3 -1, 305 V3 -1, 161

Ua -0, 618 v4 -0, 554

US -0, 045 Vs 0, 047

Dosazením do vzorců v tabulkách 3.2.3-I a 3.2.3-II se získá:

PS = -9, 108 LS = 6, 109

PT =-5, 586 Lr = 6, 264

Pu = -6, 554 L~ = 6, 431

P, , _ -6, 027 L, , = 6, 384

_3_ _36 _ fiP 5 0, 6 H` 120 0, 3

Pomocí vzorců z tabulek 3.2.3-III a 3.2.3-N se dokončí výpočet analýzy rozptylu. Výsledky jsou v tabulce 5.1.4-III.

Tab. 5.1.4-III Analýza rozptylu

Zdroj variability Stupně Součet Průměrný čtverec F-statistika Pravděpodobnost

volnosti čtverců

přípravek 3 4, 475 1, 492

regrese 1 47, 58 47, 58 7126 0, 000

nerovnoběžnost 3 0, 0187 0, 006 0, 933 0, 434

nelinearita 12 0, 0742 0, 006 0, 926 0, 531

ošetření 19 52, 152

reziduální chyba 40 0, 267 0, 0067

celkem 59 52, 42

5288

Vysoká významnost závislosti na dávce a nevýznamnost odchylky od předpokladu linearity a rovnoběžnosti potvrzují, že je možno pro zkoušku vypočítat účinnost.

Dosazením do vzorců části 3.2.5 se získá: společný sklon

b - 0, 3 x (6, 109 + 6, 264 + 6, 431 + 6, 384) - 0 80848 , 1n2x3x4 '

logaritmus relativní účinnosti přípravku T

M, __ - 5, 586 - (-9, 108) - 07752 , r 5 x 0, 90848

47, 58 _

C 47, 58 - 0, 0067 x 2, 0212 -1'00057 ,

Y - 47, 58 - 3, 8436 0, 90852 x 5 x 3

a logaritmus mezí spolehlivosti je:

1, 00057 x 0, 7752 1 0, 00057 x(1, 00057 x 0, 77522 + 2 x 3, 8436 ) = 0, 7756 1 0, 0689 .

Odlogaritmováním se získá relativní účinnost 2, 171 s 95% mezená spolehlivosti od 2, 027 do 2, 327. Všechny vzorky měly přeďpokládanou účinnost 20 Ng proteinu/ml, proto je účinnost přípravku Trovna 43, 4 Fug proteinu/ml s 95% mezemi spolehlivosti od 40, 5118 do 46, 5 pg proteinu /ml.

Stejně se vypočte odhad účinnosti a mezí spolehlivosti zbylých dvou přípravků. Výsledky jsou v tabulce 5.1.4-IV.

Tab. 5.1.4-IV

Dolní mez Odhad Horní mez

vakcína T 40, 5 43, 4 46, 5

vakcína U 32, 9 35, 2 37, 6

vakcína V 36, 8 39, 4 42, 2

5.1.5 Dvojitě křížová zkouška

Stanoveni účinnosti insulinu na králících podkožním podáním

Standardní přípravek se aplikoval v dávkách 1 a 2 jednotky na mililitr. Na základě předpokládané účinnosti neznámého přípravku (A~ = 40 jednotek na mililitr) byly připraveny ekvivalentní dávky přípravku. Jednotliví králici obdrželi podkožně 0, 5 ml odpovídajícího ředění podle plánu v tabulce 5.1.5-I. Výsledné odpovědi jsou v tabulce 5.1.5-II. Velký rozptyl, který je zřejmě způsoben variabilitou mezi jednotlivými zvířaty, ilustruje užitečnost křížového pokusu.

Tab. 5.1.5-I Uspořádání ošetření

- .

Skupina králíků

1 2 3 4

den I S, S2 T, TZ

den II T2 T, S2 S,

5289

Tab. 5.1.5-II Odpovědiy: součty hodnot glukosy v krvi (mg/l00 ml) po 1 a 2 1/2 h

Skupina 1 Skupina 2 Skupina 3 Skupina 4

S, TZ SZ T, T, Sz TZ S,

112 104 65 72 105 91 118 144

126 112 116 160 83 67 119 149

62 58 73 72 125 67 42 51

86 63 47 93 56 45 64 107

52 53 88 113 92 84 93 117

110 113 63 71 101 56 73 128

116 91 50 65 66 55 39 87

101 68 55 100 91 68 31 71

průměr 95, 6 82, 8 69, 6 93, 3 89, 9 66, 6 72, 4 106, 8

Ě 0 0 ó> _E b ~N O a v

0

Obr. 5.1.5-I

Analýza rozptylu pro tento plán zkoušky je složitější než pro jiné plány, protože složka součtu čtverců tvořená odchylkou od rovnoběžnosti není nezávislá na složce tvořené rozdíly mezi králí7ry. Test rovnoběžnosti regresních přímek vyžaduje výpočet dalšího reziduálního součtu čtverců „uvnitř králíků", který se získá odečtením složky rovnoběžnosti a dvou „interakcí" od variability způsobené rozdíly mezi králíky.

Díky opakování v každé skupině obsahuje analýza tři „interakce":

dny x přípravky, dny x regrese, dny x rovnoběžnost.

Tyto členy reprezentují náchylnost jednotlivých složek (efektu přípravku, regrese a rovnoběžnosti) měnit se den ode dne. Odpovídající F-test kontroluje platnost modelu se zřetelem na tuto skutečnost. Vysoce statisticky významné výsledky F-testu je třeba interpretovat opatrně a, pokud je to možné, zkoušku zopakovat.

Analýza rozptylu se provede dosazením do vzorců v tabulkách 3.2.3-I a 3.2.3-III zvlášť pro jednotlivé dny a pro oba dny společně. Výsledky po dosazení vzorců z tabulek 3.2.3-I a 3.2.3-II jsou:

1. den 2. den

PS =165, 25 LS = -l3 PS =173, 38 LS = -20, 06

Pr =162, 25 LT = -8, 75 Pr =176, 00 Lr = _5, 25

Hp=2=4 8 HL= 96 Hp=2=4 8 H~= 96

6 =16 6 =16

5290

oba dny dohromady:

PS =169, 31 LS = -16, 53

Pr =169, 13 Lr = -7, 00

16 192

Hp = 2 = 8 HL = G = 32

a ze vzorců z tabulky 3.2.3-III

1. den 2. den dohromady

= 18 SS ~ = 13, 781

SS~, ;~ , 000 v ~ SS~~ = 0, 141

SS, eg = 3784, 5 SS~ = 5125, 8

SS, ~ = 8859, 5

SSro„, ~b = 144, 5 SSro„, ~b = 1755, 3 SS, ~, , ~b = 1453, 5

Složky interakce se vypočtou jako 1. den + 2. den - oba dny dohromady SSd„yx~ = 31, 64

SS, nyx, ~ = 50, 77 SSd„y, ~, = 446, 27

Dále je součet čtverců způsobený rozdílu mezi dny roven:

SSdny = 2 H(Di 2 + DZZ ) - K = 478, 52

a součet čtverců způsobený rozdíly mezi bloky (mezi králíky) je:

SSbrok = 2~ Bt Z - K = 39 794, 7

kde B, je průměrná odpověď králíka.

Výsledky analýzy rozptylu jsou v tabulce 5.1.5-III.

Tab. 5.1.5-III

Zdroj variability Stupně volnosti Součet čtverců Průměrný tverec F-rozložení Pravděpodobnost

nerovnoběžnost 1 1453, 5 1453, 5 1, 064 0, 311

dny x přípravek 1 31, 6 31, 6 0, 023 0, 880

dny x regrese 1 50, 8 50, 8 0, 037 0, 849

reziduální chyba mezi 28 38 258, 8 1366, 4

králíky

králík 31 39 794, 7 1283, 7

přípravky 1 0, 14 0, 14 0, 001 0, 975

regrese 1 8859, 5 8859, 5 64, 532 0, 000

dny 1 478, 5 478, 5 3, 485 0, 072

dnyx nerovnoběžnost 1 446, 3 446, 3 3, 251 0, 082

reziduální chyba 28 3844, 1 137, 3

uvnitř králíků

celkem 63 53 423, 2 - ~ ~

Analýza rozptylu potvrdila splnění požadovaných podmínek zkoušky: Závislost na dávce (regrese) je silně významná a odchylka od předpokladu rovnoběžnosti a všechny tři interakce jsou statisticky nevýznamné.

Dosazením do vzorců části 3.2.5 se získá: společný sklon

b - 32 x (-16, 56- 7) =-33, 95 , 1n2x16x2

5291

logaritmus účinnosti

M, __ 169, 13 -169, 31 = 000276 r 2 x (-33, 95) '

__ 8859, 5 _

C 8859, 5 -137, 3 x 2, 0482 -1'0695 ,

V - 8859, 5 = 02402 (-33, 95)2 x 2 x 16

a logaritmus mezí spolehlivosti je:

1, 0695 x 0, 00276 1 0, 0695 x (1, 0695 x0, 002762 + 2 x 0, 2402) = 0, 00295 1 0, 18279.

Odlogaritmováním se získá relativní účinnost 1, 003 s 95% mezemi spolehlivosti od 0, 835 do 1, 204. Vynásobením AT = 40 se získá účinnost 40, 1 jednotek na mililitr s 95% mezemi spolehlivosti od 33, 4 do 48, 2 jednotek na mililitr.

5.2 Model poměru sklonů

5.2.1 Úplně znáhodněný plán (0, 3, 3)

Stanovení účinnosti faktoru VILI

Laboratoř provádí stanovení účinnosti v koncentrátech faktoru VIII chromogenní metodou. Laboratoř nemá zkušenosti s tímto typem zkoušky, ale pokouší se ji provést operativně. Byla připravena tři stejná ředění pro referenční a zkoušený přípravek. Navíc byly připraveny i vzorky s nulovou dávkou, přestože nebyla předpokládána linearita závislosti odpovědi (absorbance y) na dávce (x v m:l.) pro velmi nízké hodnoty. Bylo připraveno osm opakování pro každé ředění, což je více, než bývá používáno u rutinních zkoušek.

Tab. 5.2.1-I Absorbance

Nulová dávka Standard S Přípravek T

(v m.j./ml) (v m.j./ml)

koncentrace B S, S1 S3 T, T~ Tj

0, 01 0, 02 0, 03 , O₁ 0, 02 0, 03

0, 022 0, 133 0, 215 0, 299 0, 120 0, 188 0, 254

0, 024 0, 133 0, 215 0, 299 0, 119 0, 188 0, 253

0, 024 0, 131 0, 216 0, 299 0, 118 0, 190 0, 255

0, 026 0, 136 0, 218 0, 297 0, 120 0, 190 0, 258

0, 023 0, 137 0, 220 0, 297 0, 120 0, 190 0, 257

0, 022 0, 136 0, 220 0, 305 0, 121 0, 191 0, 257

0, 022 0, 138 0, 219 0, 299 0, 121 0, 191 0, 255

0, 023 0, 137 0, 218 0, 302 0, 121 0, 190 0, 254

průměr ~ 0, 0235 ~ 0, 1351 ~ 0, 2176 ~ 0, 2996 ~ 0, 1200 ~ 0, 1898 ~ 0, 2554

5292

Obr. 5.2.1-I

Grafické zobrazení výsledků potvrzuje vizuálně, že závislost odpovědi na dávce skutečně není pro nízké dávky lineární. Odpověd' na nulovou dávku nebude tedy použita pro výpočet (ke zdůvodnění tohoto rozhodnutí bude zapotřebí další zkoušky). Vzorce z tabulek 3.3.3-I a 3.3.3-II jsou:

PS = 0, 6524 Pr = 0, 5651

LS =1, 4693 LT =1, 2656

as = 0, 318 aT = 0, 318

bs = 0, 329 br = 0, 217

GS = 0, 1554 Gr = 0, 1156

JS = 4, 17 x 10"s Jr = 2, 84 x 10~

a

H, = 0, 09524 a' = 0, 05298 K =1, 9764 Analýza rozptylu je v tabulkách 5.2.1-II, 3.3.3.1-III a 3.3.3.1-IV. Tab. 5.2.1-II Analýza rozptylu

Zdroj variability Stupně volnosti Součet čtverců Průměrný čtve- F-statistika Pravděpodob

rec nost

regrese 2 0, 1917 0, 0958 24 850 0, 000

průsečík 1 3x10"9 3x10"' 7x10'9 0, 978

nelinearita 2 2x10"5 1x10"5 2, 984 0, 061

ošetření 5 0, 1917

reziduální chyba 42 1, 92x10 3, 86x10

celkem ~ 47 ~ 0, 1919

Byla tedy prokázána statisticky velmi významná závislost odpovědi na dávce, na rozdíl od statisticky nevýznamné

odchylky od předpokladu linearity a společného průsečíku. Může být tedy vypočten odhad účinnosti.

Sklon standardu je b~ = 6 x 1, 469 ~6 x 0, 0530 = 00822.

5293

Sklon zkoušeného přípravku je bT = 6 x 1, 266 84 x 0, 0530 = 00677.

Dosazením do vzorce 3.3.5.1-3 se získá R -- 00677 - 0823. 0, 0822

0, 08222

C = =1, 000083. 0, 08222 -3, 86 x 10_a x 2, 0182 x 0, 0357

K' = 0, 000083 x 0, 75 = 0, 000062

a 95% interval je 0, 823 t 0, 000083 x 1, 678 + 0, 000062 x (-1, 646) = 0, 823 1 0, 006.

Odhadovaná relativní účinnost je tedy 0, 823 s 95% mezemi spolehlivosti od 0, 817 do 0, 829.

5.2.2 Úplně znáhodněný plán (0, 4, 4, 4)

Zkouška in vitro chřipkové vakcíny

U dvou chřipkových vakcín je zjišYován obsah haemaglutininového antigenu (HA) pomocí jednoduché radiální imunodifuse. Oba přípravky mají deklarovanou účinnost 15 Ng H.A na dávku, což je ekvivalentní 30 Fug HA/ml. Standard má referenční účinnost 39 llg HA/ml.

Standard a zkoušený přípravek byly připraveny ve čtyřech koncentracích po dvou opakováních připravených na základě referenční a deklarované účinnosti. Po ustálení reakcí byla změřena zóna prstence sraženiny. Výsledky jsou zobrazeny v tabulce 5.2.2-I.

Tabulka 5.2.2-I Zóny srážení (mmZ)

Koncentrace Standard S Přípravek T Přípravek U

(llg/ml) I II I II I II

7, 5 18, 0 18, 0 15, 1 16, 8 15, 4 15, 7

15, 0 22, 8 24, 5 23, 1 24, 2 20, 2 18, 6

22, 5 30, 4 30, 4 28, 9 27, 4 24, 2 23, 1

30, 0 35, 7 36, 6 34, 4 37, 8 27, 4 27, 0

C

ZS

d

a L

U

O á

m C ~O N

~o

3s

20

IS

10

S

0

Obr. 5.2.2-I

5294

Grafické zobrazení výsledků nenaznačuje žádnou neobvyklost. Výsledky vzorců z tabulek 3.3.3-I a 3.3.3-II dávají tyto výsledky:

PS =108, 2 PT = 103, 85 PU = 85, 8

LS = 301, 1 Lr = 292, 1 LU = 234, 1

as =141, 0 a, . =116, 7 a~ =139, 8

bs = 61, 2 bT = 64, 95 bU = 39, 2

GS = 3114, 3 GT = 2909, 4 GU =1917, 3

JT = 2, 227 J~ = 0, 083

a

H~ = 0, 0093 a' = 11, 04 K =14 785, 8

a dále se vypočte analýza rozptylu, viz tabulka 5.2.2-II, za použití vzorců z tabulek 3.3.3.1-III a 3.3.3.1-IV.

Tabulka 5.2.2: II Analýza rozptylu

Zdroj variability Stupně volnosti Součet čtverců Průměrný tverec F-statistika Pravděpodobnost

regrese 3 1087, 7 362, 6 339, 5 0, 000

průsečík 2 3, 474 1, 737 1, 626 0, 237

nelinearita 6 5, 066 0, 844 0, 791 0, 594

ošetření 11 1096, 2

reziduální chyba 12 12, 815 1, 068

celkem- ~ 23 l 1109, 0 ~

Byla tedy prokázána statisticky velmi významná závislost odpovědi na dávce, na rozdíl od statisticky nevýznamné odchylky od předpokladu linearity a společného průsečíku. Může být tedy vypočten odhad účinnosti

Sklon standardu je b~ = 6 x 301, 118600 x 11, 04 = 6 356.

Sklon přípravku T je br = 6 x 292, 118600 x 11, 04 = 6056.

Sklon přípravku U je bu = 6 x 234, 118060 x 11, 04 = 4123.

To vede k odhadu relativní účinnosti 6'056 = 0, 953 pro vakcínu T a 4123 = 0649 pro vakcínu U. 6, 356 6, 356

_ 6, 3562 _

C 6, 3562 -1, 068 x 2, 1792 x 0, 0444 1.0056.

K' = 0, 0056 x 0, 625 = 0, 0035 .

A meze spolehlivosti jsou podle vzorce 3.3.5.1-4 rovny:

pro vakcínu T 0, 955 ± 0, 0056 x 1, 913 + 0, 0035 x (-1, 913) = 0, 955 1 0, 063

a pro vakcínu U 0, 649 ± 0, 0056 x 1, 423 + 0, 0035 x (-1, 301) = 0, 649 1 0, 058.

5295

Množství HA na ml se může odhadnout vynásobením relativní účinnosti a jejích mezí spolehlivosti předpokládaným obsahem 30 pg/ml. Výsledky jsou v tabulce 5.2.2-III.

Tab. 5.2.2-III Odhad obsahu HA (ltg/ml)

Dolní mez Odhad Horní mez

vakcína T 13, 4 14, 3 15, 3

vakcína U 8, 9 9, 7 10, 6

5.3 Kvantální zkoušky

5.3.1 Probitová analýza, zkoušení přípravku proti referenčnímu vzorku

Zkouška in vitro vakcíny difterie

Vakcína difterie (s předpokládanou účinností 140 m.j./lahvičku) byla testována oproti standardu (s referenční účinností 132 m j./lahvičku). Na základě této informace byly připraveny ekvivalentní dávky. Ty byly náhodně přiděleny skupinám morčat. Po daném časovém intervalu byla morčata imunizována toxinem difterie a dále byly zaznamenány počty zvířat, které přežily, viz. tabulka 5.3.1-I.

Tab. 5.3.1-I Výchozí data zkoušky difterie na morčatech

Standard (S) Zkoušený přípravek (T)

stanovená účinnost 140 m.j./ml předpokládaná účinnost 140 m.j./ml

Dávka Počet Počet Dávka Počet Počet

(m.j./ml) exponovaných přeživších (m.j./ml) exponovaných přeživších

1, 0 12 0 1, 0 11 0

1, 6 12 3 1, 6 12 4

2, 5 12 6 2, 5 11 8

4, 0 11 10 4, 0 11 10

Pozorování byla přenesena do první pracovní tabulky, kde jsou vypočteny ještě další sloupce tak, jak je popsáno v části 4.2.1. Tabulka 5.3.1-II obsahuje první iterační cyklus.

Jsou vypočteny součty posledních šesti sloupců a přeneseny do druhé pracovní tabulky, viz tabulka 5.3.1-III. Ostatní sloupce jsou vypočteny pomocí vzorců 4.2.1-4 až 4.2.1-10. Odtud se získá i společný sklon b =1, 655 (podle vzorce 4.2.1-9).

Hodnoty Y v první pracovní tabulce se nyní nahradí hodnotami a + bx a provede se druhý iterační cyklus, viz tabulka 5.3.1-IV.

Iterační cyklus se opakuje, dokud není rozdíl mezi po sobě následujícími cykly dostatečně malý. Tak se získá druhá pracovní tabulka 5.3.1-V.

Tab. 5.3.1-II První pracovní tabulka v prvním iteračním cyklu

Dávka n r x p Y ~ Z y w wx wy ~~ wxy

S 1, 0 12 0 0, 000 0, 000 0 0, 5 0, 399 -1, 523 7, 64 0, 00 -9, 57 0, 00 12, 00 0, 00

1, 6 12 3 0, 470 0, 250 0 0, 5 0, 399 -0, 627 7, 64 3, 59 -4, 79 1, 69 3, 00 -2, 25

2, 5 12 6 0, 916 0, 500 0 0, 5 0, 399 0, 000 7, 64 7, 00 0, 00 6, 41 0, 00 0, 00

4, 0 11 10 1 86 0909 0 0 0 99 1025 700 971 7, 18 13, 46 7 9, 95

T 1, 0 11 0 0, 000 0, 000 0 0, 5 0, 399 -1, 253 7, 00 0, 00 -8, 78 0, 00 11, 00 0, 00

1, 6 12 4 0, 470 0, 333 0 0, 5 0, 399 -0, 412 7, 64 3, 59 -3, 19 1, 69 1, 33 -1, 50

2, 5 11 8 0, 916 0, 727 0 0, 5 0, 399 0, 570 7, 00 6, 42 3, 99 5, 88 2, 27 3, 66

4, 0 11 10 1 86 0 909 0 0 0 99 1025 7, 00 9 71 718 13 46 7, 36 9 95

5296

Tab. 5.3.1-III Druhá pracovní tabulka v prvním iteračním cyklu

w ~ wx ~ wy ~ wxa ~ wy z ~ wxy S~ S~, S, ~ x ý a

S 29, 92 20, 30 -7, 18 21, 56 22, 36 7, 70 7, 79 12, 58 20, 64 0, 68 -0, 24 -1, 36

T ~ 28, 65 ( 19, 72 ~ -0, 80 ~ 21, 03 21, 97 12, 11 7, 64 12, 66 21, 95 0, 69 -0, 03 -1, 17

Tab. 5.3.1-IV První pracovní tabulka v druhém iteračním cyklu

Dávka n r x p Y ~ Z y w wx wy ~~ wxz

S 1, 0 12 0 0, 000 0, 000 -1, 36 0, 086 0, 158 -1, 911 3, 77 0, 00 -7, 21 0, 00 13, 79 0, 00

1, 6 12 3 0, 470 0, 250 -0, 58 0, 279 0, 336 -0, 672 6, 74 3, 17 -4, 53 1, 49 3, 04 -2, 13

2, 5 12 6 0, 916 0, 500 0, 15 0, 561 0, 394 -0, 001 7, 57 6, 94 -0, 0l 6, 36 0, 00 -0, 01

4, 0 i l 10 1, 386 0, 909 0, 93 0, 824 0, 258 1, 260 5, 07 7, 03 6, 39 9, 75 8, 05 8 86

T 1, 0 11 0 0, 000 0, 000 -1, 17 0, 122 0, 202 -1, 769 4, 20 0, 00 -7, 43 0, 00 13, 14 0, 00

1, 6 12 4 0, 470 0, 333 -0, 39 0, 349 0, 370 -0, 430 7, 23 3, 40 -3, 11 1, 60 1, 34 -1, 46

2, 5 i l 8 0, 916 0, 727 0, 35 0, 637 0, 375 0, 591 6, 70 6, 14 3, 96 5, 62 2, 34 3, 63

4 0 11 10 1386 0 909 1 13 0 870 0 211 1, 311 4 3 6, 03 5, 70 8, 36 7, 48 7 90

Tab. 5.3.1-V Druhá pracovní tabulka po dostatečném počtu cyklů.

w ~ wx ~ wy ~wxz ~ wyz ~ wxy S~ Sem, Sn, x Y a

S 18, 37 14, 80 -2, 14 14, 85 17, 81 5, 28 2, 93 7, 00 17, 56 0, 81 -0, 12 -2, 05

T ~ 17, 96 ~ 12, 64 ~ -0, 55 J 11, 86 ~ 18, 35 T 6, 76 2, 96 7, 15 18, 34 0, 70 -0, 03 -1, 72

Test linearity je popsán v části 4.2.2. Hodnota X~ 0 4 stupních volnosti je 0, 836 + 1, 069 = 1, 905 a té odpovídá p-hodnota 0, 780, což neprokazuje statisticky významnou odchylku od linearity.

Protože odchylka od linearity není statisticky významná, je možno provést test rovnoběžnosti popsaný ve stejné

z

části. X, .z s jedním stupněm volnosti je (16, 724+17, 271)-14'15 =0, 002. To odpovídáp-hodnotě 0, 964, což není statis5, 89

ticky významné.

Z tabulky 5.3.1-V se podle vzorce 4.2.1-9 vypočte:

b - 7, 00+ 7, 15 - 14, 15 - 2402 2, 93+ 2, 96 5, 89

pomocí vzorců z části 4.2.3 je možno odhadnout logaritmus relativní účinnosti

M, -1, 721-(-2, 05) = 0137,

r - 2, 402

dále

C - 2, 4022 x 5, 893 =1127 2, 4022x5, 893-12x1, 9602 '

v = 1 + 1 = o, l 10, 18, 34 17, 56

5297

takže ln mezí spolehlivosti je:

0, 155 - 0, 013 1 0, 127(0, 649 + 1, 127 x 0, 036=) = 0, 142 1 0, 288.

Odlogaritmováním a vynásobením předpokládanou účinností (140 m.j./lahvičku) se získá účinnost a její meze spolehlivosti. Odhad účinnosti je 160, 6 m.j./lahvičku s 95% mezemi spolehlivosti od 121, 0 do 215, 2 m.j./lahvičku.

Obr. 5.3.1-I

5.3.2 Logitová analýza a jiné typy analýzy zkoušeného přípravku proti referenčnímu vzorku

V této části jsou uvedeny výsledky analýz dat z části 5.3.1 získané logitovou analýzou a jinými klasickými metodami. Následující příklad by měl být spíše považován za cvičení než za alternativní řešení příkladu v části 5.3.1. Jiný tvar křivky by měl být použit pouze, pokud pro to existují dostatečné empirické nebo teoretické důvody.

Tab. 5.3.2: I Výsledky použití alternativních křivek

Logit Gompit Sinit

1 1-e_er 1 siny+ 1

1+e_Y 2 2

Z E_Y CY_er 1

Y

(1+e-Y)z -cos

2

sklon b 4, 101 2, 590 1, 717

Xz linearity 2, 15 3, 56 1, 50

Xi rovnoběžnosti 0, 0066 0, 168 0, 0010

účinnost 162, 9 158, 3 155, 8

dolní mez 121, 1 118, 7 122, 6

horní mez 221, 1 213, 3 200, 7

~~1Je-li Y<-Žer, pak t=0a Z=0 aje-li Y>-žer, pak d~=1 a Z=O.

5298

5.3.3 Stanovení ED~ přípravku pomocí probitové metody

In vitro zkouška perorální poliomyelitické vakcíny

Pro stanovení EDS° peoráhú poliomyelitické vakcíny bylo použito 10 ředění s osmi opakováními 50 pl na Elisaplotnách, výsledky zkoušky jsou v tabulce 5.3.3-I.

Tab. 5.3.3-I Ředění (lOX ~1 původní vakcíny)

-3, 5 -4, 0 -4, 5 -5, 0 -5, 5 -6, 0 -6, 5 -7, 0 -7, 5 -8, 0

Pozorované výsledky jsou převedeny do první pracovní tabulky a v ní jsou vypočteny i ostatní sloupce, jak jsou popsány v části 4.2.1. V tabulce 5.3.3-II je zobrazen první cyklus iterační procedury.

Dále je vypočten součet posledních šesti sloupců a převeden do divhé pracovní tabulky (viz tabulka 5.3.3-III). Pomocí vzorců 4.2.1-4 až 4.2-10 se vypočtou zbylé sloupce a získá se společný sklon b =-0, 295.

Hodnoty Y v první pracovní tabulce se nahradí hodnota a + bx a dokončí se druhý iterační cyklus. V iteračním procesu se pokračuje, dokud není rozdíl mezi dvěma po sobě následujícími cykly dostatečně malý. Tabulka 5.3.3-IV obsahuje údaje z druhé pracovní tabulky po ukončení iteračního procesu.

Tab. 5.3.3-I První pracovní tabulka prvního iteračního cyklu

Dávka n r x !' Y c~ Z Y w wx wxZ

T 10-3 8 0 -8, 06 0, 000 0, 00 0, 5 0, 399 -1, 253 5, 09 -41, 04 -6, 38 330, 8 8, 00 51, 4

10~° 8 0 -9, 21 0, 000 0, 00 0, 5 0, 399 -1, 253 5, 09 -46, 91 fi, 38 432, 0 8, 00 58, 8

10°~ 8 1 -10, 36 0, 125 0, 00 0, 5 0, 399 -0, 940 5, 09 -52, 77 -4, 79 546, 8 4, 50 49, 6

10"x° 8 2 -11, 51 0, 250 0, 00 0, 5 0, 399 -0, 627 5, 09 -58, 63 -3, 19 675, 1 2, 00 36, 7

10"'~ 8 6 -12, 66 0, 750 0, 00 0, 5 0, 399 0, 627 5, 09 -64, 50 3, 19 816, 8 2, 00 -00, 4

10~° 8 7 -13, 82 0, 875 0, 00 0, 5 0, 399 0, 940 5, 09 -70, 36 4, 79 972, 1 4, 50 X6, 1

10~~ 8 7 -14, 97 0, 875 0, 00 0, 5 0, 399 0, 940 5, 09 -76, 23 4, 79 1140, 8 4, 50 -71, 7

10'''° 8 8 -16, 12 1, 000 0, 00 0, 5 0, 399 1, 253 5, 09 -82, 09 6, 38 1323, 1 8, 00 -102, 9

10~ 8 8 -17, 27 1, 000 0, 00 0, 5 0, 399 1, 253 5, 09 -87, 95 6, 38 1518, 9 8, 00 -11Q~

10~° 8 8 -18 42 1000 0 00 0 5 0 399 1 53 5, 09 -93 82 6, 38 1728 8 00 -117, 6

Tab. 5.3.3-II Druhá pracovní tabulka prvního iterační~o cyklu

w ~ wx ~ wy ~wz~ ~wyl ~wx S~, Sem, S», ž y a

T 50, 93 -074, 3 l 1, 17 9484, 6 57, 50 -312, 4 556 92 -164 43 55 OS -13 4 0, 219 T -3, 690

Tab. 5.3.3-III Druhá pracovní tabulka po provedení dostatečného počtu iterací

w ~ wx ~ wy ~ wx 2 ~wy~ ~wx S~ Sem, Sn, ž Ý a

T 19, 39 -238, 2 0, 11 2981, 1 26, 05 -37, 45 55, 88 -36, 11 26, 05 -12 8 0, 006 ~ -7, 931

5299

Částka 17

Linearita se otestuje pomocí vzorců z části 4.2.2. Hodnota x2 0 osmi stupních volnosti je 2, 711 a tomu odpovídáphodnota 0, 951, což není statisticky významné.

Je tedy možno pomocí vzorců z části 4.5 odhadnout relativní účinnost,

M, - - (-7, 931) _ -12, 273, - 0, 646

dále

C - (-0, 646)2 x 55, 883 - ] 197

(-0, 646)2 x 55, 883 -12 x 1, 962 ' '

V = 1 = 0, 052. 19, 39

Logaritmus mezí spolehlivosti je tedy roven

14, 692-(-2, 420)± 0, 197x(2, 882+1, 197x0, 0092)=-12, 272±0, 754.

Tento odhad je stále ve tvaru ln(ředění). Odhad vyjádřený jako In(EDso)/ml je

_1000

-MŤ+InC 50 )~

Protože je obvyklé vyjadřovat účinnost této vakcíny ve tvaru log, °(EDso~/ml výsledky musí být vyděleny ln(10). Odhadem účinnosti pak je 6, 63 log, o(EDso)/ml s 95% mezemi spolehlivosti od 6, 30 do 6, 96 log, °~EDS°~/ml.

a 0, 3 0, 2 0, 1 0, 0 Obr. Sá.3-I. Závislost pravděpodobnosti pozitivní odpovědi na ředění

5300

6 Kombinace výsledků zkoušky

6.1 Úvod

Ke splnění požadavků lékopisu je často nutné zkoušku nezávisle opakovat a výsledky kombinovat. Pak se naskýtá otázka, zda je vhodné kombinovat takové zkoušky, a pokud ano, jakým způsobem.

Zkoušky Ize považovat za navzájem nezávislé, když výsledky jedné zkoušky neovlivňují výsledky jiné. Také náhodné chyby ve všech faktorech ovlivňujících výsledek (např. ředění standardu a zkoušeného přípravku, citlivost biologického ukazatele) v jedné zkoušce musí být nezávislé na stejné chybě ve druhé zkoušce. Zkoušky ve dnech po sobě následujících, používající původní ředění standardu, tedy nezávislé nejsou.

Existuje několik způsobů kombinování výsledků nezávislých zkoušek, ty teoreticky nejvhodnější jsou ale také nejobtížněji použitelné. Dále jsou popsány tři přibližné metody. Mohou být použity i další za předpokladu splnění nutných podmínek.

Před kombinováním odhadů účinnosti získaných pomocí modelu rovnoběžnosti je nutné pracovat s logaritmem účinnosti. Při použití modelu poměru sklonů se pracuje přímo s účinností. Protože v praxi je častěji používán model rovnoběžnosti než model poměru sklonů, je použit v této části symbol M, označující přirozený logaritmus účinnosti. Při modelu poměru sklonů se použijí stejné vzorce, v nichž se pod M rozumí účinnost R, a nikoliv její logaritmus. Před kombinováním musí být všechny odhady účinnosti upraveny na stanovenou účinnost každého zkoušeného přípravku.

6.2 Vážený průměr výsledků zkoušek

Podmínky použití této metody:

1. odhady účinnosti jsou z nezávislých zkoušek, 2. v každé zkoušce je Cblízké 1 (menší než 1, 1), 3. počet stupňů volnosti jednotlivých reziduálních chyb není menší než 6, pokud možno je větší než 15, 4. jednotlivé odhady účinnosti tvoří homogenní skupinu. Test homogenity je popsán v části 6.2.2.

Pokud tyto podmínky nejsou splněny, metodu nelze použít. Metody v následující části 6.3 mohou sloužit k získání nejlepšího odhadu průměrné účinnosti jako předpokládané účinnosti pro další zkoušky.

6.2.1 Výpočet váhových koeficientů

Po vyhodnocení každé z n' nezávislých validních zkoušek je k dispozici n' hodnot M a příslušných mezí spolehlivosti. Pro každou zkoušku se určí délka intervalu spolehlivosti L jako rozdíl horní a dolní meze. Váha W pro každou hodnotu M se vypočte pomocí vzorce 6.2.1-I, kde t je stejná hodnota jako při výpočtu mezí spolehlivosti:

6.2.2 Homogenita odhadů účinnosti

Umocněním každé odchylky M od váženého průměru, vynásobením příslušnou váhou W a součtem přes všechny zkoušky se získá statistika s přibližně Xs rozdělením. Ta může být použita k testování homogenity odhadů logaritmů účinnosti v n' nezávislých zkouškách.

, ~zx~W(M-M )z kde M= GW (6.2.2-1) n'

Je-li vypočtené Xz menší než tabelovaná hodnota pro (n' -1) stupňů volnosti, není významně porušena homogenita účinností a je možno průměrnou účinnost a meze spolehlivosti určit pomocí metody z části 6.2.3.

Je-li Xz Větší než tabelovaná hodnota, jsou účinnosti nehomogenní. To znamená, že rozdíly mezi jednotlivými odhady M jsou významně větší, než odpovídá odhadům jejich mezí spolehlivosti, tj. je statisticky významná variabilita mezi

5301

zkouškami. Rozdíly mezi zkouškami jsou tedy významné, takže podmínka 4 není splněna a není možno použít vzorce z části 6.2.3, místo nich se použijí vzorce ze části 6.2.4.

6.2.3 Výpočet vážených průměrů a mezí spolehlivosti

Pro výpočet váženého průměru logaritmů účinností se vypočtou součiny WMpro každou zkoušku a jejich součet se vydělí celkovým součtem vah všech zkoušek.

WM

M=

W

(6.2.3-1)

Střední chyba ln(průměrné účinnosti) je odmocnina převrácené hodnoty součtu všech hmotností.

SM

(6.2.3-2)

Pňbližné meze spolehlivosti se získají odlogaritmováním hodnot:

M t tsM

(6.2.3-3)

kde počet stupňů volnosti t je roven součtu stupňů volnosti střední chyby jednotlivých zkoušek.

6.2.4 Vážený průměr a meze spolehlivosti založené na vnější a vnitřní individuální variabilitě zkoušky

Pokud je kombinováno několik opakováni zkoušek, může být hodnota 7Ca statisticky významná. Pak se pozorovaný rozptyl skládá ze dvou složek:

• intra zkoušková variabilita s Z„, =1/W ,

inter zkoušková variabilita s ~ _ ~(M, _ M)z n (n -1)

kde M je nevážený průměr. První složka se mění zkoušku od zkoušky, zatímco druhá je společná pro všechna M. Pro každé M se vypočte váhový koeficient

W'=

který nahradí W z části 6.2.3, kde je t aproximováno hodnotou 2.

6.3 Nevážená kombinace výsledků zkoušek

Nejjednodušší způsob kombinace n' odhadů M z n' zkoušek je vypočítat průměr M a jeho směrodatnou odchylku odhadnout jako

2 _ ~(M_M)2 n~(n~ -1)

5302

Meze spolehlivosti pak jsou

M t tsM

(6.3-2)

kde t má (n' -1) stupňů volnosti. Počet n' odhadů M je obvykle malý, proto bývá hodnota t poměrně velká.

6.4 Příklad vážené průměrné účinnosti a jejích mezí spolehlivosti

V tabulce 6.4-I je šest nezávislých odhadů účinnosti stejného přípravku společně s jejich 95% intervaly spolehlivosti a s počtem stupňů volnosti jejich reziduálních směrodatných odchylek. Podmínky 1, 2 a 3 části 6.2 jsou splněny. Logaritmy účinností a váhy jsou vypočteny tak, jak je popsáno v části 6.2.

Tab. 6.4-I Odhady účinnosti a intervaly spolehlivosti šesti nezávislých zkoušek.

Odhad účinnosti Dolní mez Horní mez Stupně volnosti ln účinnosti M Váhy W

(m.j./lahvičku) (m.j./lahvičku) (mj./lahvičku)

18 367 17 755 19 002 20 9, 8183 3777, 7

18 003 17 415 18 610 20 9, 7983 3951, 5

18 064 17 319 18 838 20 9, 8017 2462, 5

17 832 17 253 18 429 20 9, 7887 4003, 0

18 635 17 959 19 339 20 9, 8328 3175, 6

18 269 17 722 18 834 20 9, 8130 4699, 5

Homogenita odhadů účinnosti je hodnocena vzorcem 6.2.2-1, ktery" poskytuje hodnotu Xz = 4, 42, který má 5 stupňů

volnosti, což neni statisticky významné (p = 0, 49). Podmínky jsou tedy splněny. Vážený priuněr vypočtený vzorcem 6.2.3-1 je roven 9, 8085.

Vzorec 6.2.3-2 poskytuje odhad směrodatné odchylky 0, 00673. Přibližné 95% meze spolehlivosti od 9, 7951 do 9, 8218 se získají ze vzorce 6.2.3-3, kde t má 120 stupňů volnosti.

Po odlogaritmování je odhad účinnosti rovný 18 187 m.j.llahvičku a 95% meze spolehlivosti od 17 946 do 18 431 m.j./lahvičku.

7 Další postupy

Není možné, aby lékopisný text obsahoval úplný popis statistických metod. Nicméně metody popsané v této stati by měly stačit pro většinu lékopisných potřeb. Tato část se pokouší dát abstraktnější přehled alternativních nebo obecnějších metod, které byly vyvinuty. Čtenář zajímající se o tuto problematiku by se měl věnovat studiu další literatury z této oblasti. Použití speciálnějších statistických metod musí být v každém případě prováděno kvalifikovanou osobou.

7.1 Obecný lineární model

Metody zmíněné v tomto textu mohou být popsány prostřednictvím obecného lineárního modelu (nebo zobecněný lineární model zalunuje probitovou a logitovou metodu). Nejprve je nutno definovat lineární strukturální matici X (nebo matici plánu), ve které každý řádek představuje jedno pozorováni a každý sloupec lineární efekt (přípravek, blok, sloupec, dávku). Např. plán latinských čtverců z příkladu 5.1.2 je popsán maticí s 36 řádky a 13 sloupci. Jeden sloupec pro každý přípravek, jeden sloupec pro každou dávku, pět sloupců pro každý blok s výjimkou prvního. Všechny sloupce s výjimkou sloupců pro dávky jsou vyplněny čísly 0 nebo 1 podle toho, zda tomuto pozorování odpovídá příslušný efekt. Vektor Y obsahuje (transformované) pozorované hodnoty. Efekty jsou odhadovány vzorcem (X'X)-~X`Y a z nich jako podíl odpovídajících efektů se vypočte odhad účinnosti m. Intervaly spolehlivosti se vypočtou pomocí Fiellerovy věty:

5303

z

mi>mu- m-~~z t b vii-2mv~z+mzvzz-gCvii- v'? zz zz

kde g =

tzszvzz

bz

a v„, vzz a v, z představují rozptyly čitatele, jmenovatele a jejich kovarianci. Ty se získají přímo z (, Y`, y)-' nebo nepřímo z var (a~ - az ) = var (a~ ) + var (az ) - 2 cov (a~, az ) a cov (a, - az, b) = cov (a, , b) - cov (az, b) .

Úplná analýza rozptylu, ve které jsou obsaženy všechny komponenty, je poněkud komplikovanější. Matice Xby musela být rozšířena o další sloupce, umožňující testovat předpoklad rovnoběžnosti a linearity. Pro zkoušku závisející na kvantální odpovědi se najdou lineární efekty (průsečíky as, aT atd. a společný sklon b se získá maximalizací součtu

n ln d~(a, + bx) + (n - r) ln(1- ~(a~ + bx)) , kde je x logaritmus dávky, ~ představuje tvar rozložení a i e {S, T, ...} .

7.2 Heterogenita rozptylů

Heterogenita rozptylů se vždy nepodaří odstranit jednoduchou transformací odpovědí. Vhodnou cestou k řešení tohoto problému je použití vážené lineární regrese. K získání nevychýlených odhadů se za váhu pozorování použijí převrácené hodnoty rozptylů chyb. Protože skutečná hodnota rozptylu chyby není vždy známa, může být použita iterační metoda opakovaného vážení. Výpočet intervalů spolehlivosti ale přináší další problémy.

7.3 Odlehlá pozorování a robustní metody

Metoda nejmenších čtverců, popsaná v tomto textu, má nevýhodu v tom, že je silně ovlivněna případnými odlehlými pozorováními. Jasně odlehlá pozorování mohou zcela znehodnotit celý výpočet. Tento problém se obvykle řeší vyloučením odlehlých hodnot ze zpracovávaných dat. Tento postup může vést k účelovému zamítnutí libovolných dat a to není bez nebezpečí. Je složité dát obecný návod, jak rozhodnout, zda konkrétní pozorování je, či není odlehlé. Pro tyto účely bylo vyvinuto mnoho robustních metod. Tyto metody jsou méně citlivé na odlehlá pozorování, protože kladou menší důraz na hodnoty vzdálené od předpokládaného odhadu. Nové problémy se obvykle objeví při konstrukci intervalu spolehlivosti nebo deimici minimalizované ztrátové funkce.

7.4 Korelace chyb

Úplné znáhodnění není vždy uskutečnitelné nebo je velmi nežádoucí z praktického důvodu. Pak jednotlivé dávky v ředící řadě vedou ke korelovaným chybám způsobujícím, že meze spolehlivosti jsou mnohem užší. Byly vyvinuty metody, které berou v úvahu tento efekt autokorelace.

8 Tabulky a algoritmy

V tabulkách této části jsou otištěny kritické hodnoty pro nejčastěji se vyskytující stupně volnosti. Pokud některé kritické hodnoty zde nejsou uvedeny, je nutno použít rozsáhlejší statistické tabulky. Mnohé počítačové programy v sobě zahrnují statistické funkce, ty pak jsou vhodnější než tabulky v této části. Jinou alternativou jsou dále popsané procedury, které vypočtou pravděpodobnost odpovídající daným statistikám při zadaných stupních volnosti.

5304

8.1 Tabulka kritických hodnot F-rozdělení

svl-~ 1 2 3 4 5 6 8 t0 12 IS 20 00

sv2

10 4, 965 4, 103 3, 708 3, 478 3, 326 3, 217 3, 072 2, 978 2, 913 2, 845 2, 774 2, 538

10, 044 7, 559 5, 994 5, 994 5, 636 5, 386 5, 057 4, 849 4, 706 4, 558 4, 405 3, 909

12 4, 747 3, 885 3, 490 3, 259 3, 106 2, 996 2, 849 2, 753 2, 687 2, 617 2, 544 2, 296

9, 330 6, 927 5, 953 5, 412 5, 064 4, 821 4, 499 4, 296 4, 155 4, 010 3, 858 3, 361

15 4, 543 3, 682 3, 287 3, 056 2, 901 2, 790 2, 641 2, 544 2, 475 2, 403 2, 328 2, 066

8, 683 6, 359 5, 417 4, 893 4, SSb 4, 318 4, 004 3, 805 3, 666 3, 522 3, 372 2, 868

20 4, 351 3, 493 3, 098 2, 866 2, 711 2, 599 2, 447 2, 348 2, 278 2, 203 2, 124 1, 843

8, 096 5, 849 4, 938 4, 431 4, 103 3, 871 3, 564 3, 368 3, 231 3, 088 2, 938 2, 421

25 4, 242 3, 385 2, 991 2, 759 2, 603 2, 490 2, 337 2, 236 2, 165 2, 089 2, 007 1, 711

7, 770 5, 568 4, 657 4, 177 3, 855 3, 627 3, 324 3, 129 2, 993 2, 850 2, 699 2, 169

30 4, 171 3, 316 2, 922 2, 690 2, 534 2, 421 2, 266 2, 165 2, 092 2, 015 1, 932 1, 622

7, 562 5, 390 4, 510 4, 018 3, 699 3, 473 3, 173 2, 979 2, 843 2, 700 2, 549 2, 006

50 4, 034 3, 183 2, 790 2, 557 2, 400 2, 286 2, 130 2, 026 1, 952 1, 871 1, 784 1, 438

7, 171 5, 057 4, 199 3, 720 3, 408 3, 186 2, 890 2, 698 2, 563 2, 419 2, 265 1, 683

00 3, 841 2, 996 2, 605 2, 372 2, 214 2, 099 1, 938 1, 831 1, 752 1, 666 1, 571 1, 000

6 635 4 605 3 782 3 319 3 017 2 802 2 511 2 321 2185 2 039 1878 1, 000

Pokud je pozorovaná hodnota větší než tabelovaná, je test považován za statisticky významný (horní řádek, p = 0, 05) nebo vysoce statisticky významný (dolní řádek, p = 0, 01). svl je počet stupňů volnosti čitatele a sv2 jmenovatele.

Počítačový postup: Nechť F je vypočtená testovací statistika, svl, sv2 výše popsané stupně volnosti a pi = n = 3, 14159265358979... . Následující program vypočte odpovídajícíp-hodnotu.

Je-li sv 1 sudé Je-li sv 1 liché a sv2 sudé Je-li sv 1 a sv2 liché

x=svl/(svl+sv2/F) x=sv2/(sv2+svl*F) x=atn(sgr(svl*F/sv2))

s=1:t=1 s=1:t=1 cs=cos(x):sn=sin(x):x=x/2

for i=2 to (svl-2) step 2 for i=2 to (sv2-2) step 2 s=O:t=sn*cs/2:v=0:w=1

t=t*x*(sv2+i-2)/i t=t*x*(svl+i-2)/i for i=1 to (sv2-1) step 2

s=s+t s=s+t s=s+t

next i next i t=t*i/(i+1)*cs*cs

p=s*(1-x)^(sv2/2) p=1-s*(1-x)^(svl/2) next i

for i=1 to (svl-2) step 2

v=v+w

w=w*(sv2+i)/(i+2)*sn*sn

next i

p=1+(t*sv2*v-x-s)/pi*9

5305

8.2 Tabulka kritických hodnot t- rozdělení

sv p = 0, 05 p = 0, 01

1 12, 706 63, 656

2 4, 303 9, 925

3 3, 182 5, 841

4 2, 776 4, 604

5 2, 571 4, 032

6 2, 447 3, 707

7 2, 365 3, 499

8 2, 306 3, 355

9 2, 262 3, 250

10 2, 228 3, 169

12 2, 179 3, 055

14 2, 145 2, 977

16 2, 120 2, 921

18 2, 101 2, 878

20 2, 086 2, 845

sv p = 0, 05 p = 0, 01

22 2, 074 2, 819

24 2, 064 2, 797

26 2, 056 2, 779

28 2, 048 2, 763

30 2, 042 2, 750

35 2, 030 2, 724

40 2, 021 2, 704

45 2, 014 2, 690

50 2, 009 2, 678

60 2, 000 2, 660

70 1, 994 2, 648

80 1, 990 2, 639

90 1, 987 2, 632

100 1, 984 2, 626

00 1, 960 2, 576

Pokud je pozorovaná hodnota větší než tabelovaná, je test považován za statisticky významný (horní řádek, p = 0, 05) nebo vysoce statisticky významný (dolní řádek, p = 0, 01).

Počítačový postup: p-hodnota pro t-rozdělení s sv stupni volnosti se vypočte pomocí postupu v části 8.1, kde F = tz, svl = 1 a sv2 = sv.

Kritickou hodnotu t-rozdělení (p = 0, 05) pro daný počet stupňů volnosti sv vypočteme pomocí následujícího postupu s přesností na 6 platných míst.

t = 1, 95994+ 2, 37228/sv+ 2, 82202/sv^2+ 2, 56499/sv^3+ 1, 51956/sv^9+ 1.02579/sv^5+ 0, 94210/sv^7

8.3 Tabulka kritických hodnot x2-rozdělení

sv p = 0, 05 p = 0, 01

1 3, 841 6, 635

2 5, 991 9, 210

3 7, 815 11, 345

4 9, 488 13, 277

5 11, 070 15, 086

6 12, 592 16, 812

7 14, 067 18, 475

8 15, 507 20, 090

9 16, 919 21, 666

10 18, 307 23, 209

sv p = 0, 05 p = 0, 01

11 19, 675 24, 725

12 21, 026 26, 217

13 22, 362 27, 688

14 23, 685 29, 141

15 24, 996 30, 578

16 26, 296 32, 000

20 31, 410 37, 566

25 37, 652 44, 314

30 43, 773 50, 892

40 55, 758 63, 691

Pokud je pozorovaná hodnota větší než tabelovaná, je test považován za statisticky významný (horní řádek, p = 0, 05) nebo vysoce statisticky významný (dolní řádek, p = 0, 01).

Počítačový postup: Nechť x2 je vypočtená hodnota Xz a sv stupně volnosti, pakp-hodnotu vypočte postup:

5306

Je-li sv sudé Je-li sv liché

s=1 : t=exp(-x2/2) x=sgr(x2) : s=0

for i=2 to sv step 2 t=x*exp(-x2/2)/sgr(pi/2)

s=s+t for i=3 to sv step 2

t=t*x2/i s=s+t : t=t*x2/i

next i next i

p=1-s p=1-s-2*phi (x)

kde phi je hodnota kumulativní distribuční funkce normálního rozděleními (viz část 8.4).

8.4 Tabulka kritických hodnot d>-rozdělení

x

0, 00 0, 500

0, 05 0, 520

0, 10 0, 540

0, 15 0, 560

0, 20 0, 579

0, 25 0, 599

0, 30 0, 618

0, 35 0, 637

0, 40 0, 655

0, 45 0, 674

0, 50 0, 691

0, 55 0, 709

0, 60 0, 726

0, 65 0, 742

0, 70 0, 758

0, 75 0, 773

0, 80 0, 788

0, 85 0, 802

0, 90 0, 816

0, 95 0, 829

x (~

1, 00 0, 841

1, 05 0, 853

1, 10 0, 864

1, 15 0, 875

1, 20 0, 885

1, 25 0, 894

1, 30 0, 903

1, 35 0, 911

1, 40 0, 919

1, 45 0, 926

1, 50 0, 933

1, 55 0, 939

1, 60 0, 945

1, 65 0, 951

1, 70 0, 955

1, 75 0, 960

1, 80 0, 964

1, 85 0, 968

1, 90 0, 971

1, 95 0, 974

x cp

2, 00 0, 977

2, 05 0, 980

2, 10 0, 982

2, 15 0, 984

2, 20 0, 986

2, 25 0, 988

2, 30 0, 989

2, 35 0, 991

2, 40 0, 992

2, 45 0, 993

2, 50 0, 994

2, 55 0, 995

2, 60 0, 995

2, 65 0, 996

2, 70 0, 997

2, 75 0, 997

2, 80 0, 997

2, 85 0, 998

2, 90 0, 998

2, 95 0, 998

Pro záporná x je: cb(x) =1- ~(-x) .

Počítačový postup: Následující postup vypočte pro 0 5 x 5 8, 15 odpovídající hodnotu funkcemi . Je-li větší než 8, 15, pak se položí ~ = 1. Pokud je x záporné, je možno použít výše zmíněný vzorec. Tento postup předpokládá, že počítač pracuje asi s patnácti platnými místy. Pokud je použit jiný počet platných čísel, je nutno provést jisté prosté úpravy postupu.

s=0 . t=x . i=1 repeat

s=s+t : i=i+2 : t=t*x*x/i until t<1E-16 phi=0.5+s*exp(-x*x/2)/sgr(2*pi)

8.5 Náhodné permutace

Pro plán náhodných bloků se potřebují náhodné permutace. Následující algoritmus ukazuje, jak použít zabudovaný generátor náhodných čísel k vytvoření náhodných permutací N ošetření.

1. Do řádku se zapíše všech N ošetření.

2. Získá se celé náhodné číslo r z intervalu 1 <_ r <_ N, 3. V řádku se vymění r-té ošetření s N-tým.

5307

4. Položí se N = N- 1 a zopakují se kroky 2 až 4, dokud nebude N= 1.

Příklad algoritmu pro 6 ošetření

1 N=6 S, Sz Ss T, Tz T3

2 r=2 F

3 S, T3 Ss ?'~ . Tz Sz

4 N=5

2 r=4

3 T3 Sa Tz T, Sz

4 N=4

2 r=4

3 S, Tz T, I

4 N=3

2 r=1

3 S3 T3 S, Tz T, Sz

4 N=2

2 r=1 F

3 T3 S3 S, Tz T, Sz

4 N=1

8.6 Latinské čtverce

Dále je uvedeno použití tří nezávislých permutací k vynoření latinského čtverce. l. Vygeneruje se jedna náhodná permutace N ošetření (viz část 8.5):

T3

Ss

S,

Tz

T,

Sz

2. Nyní se dá jednoduchý latinský črierec vynořit pomocí „rotace" této permutace doprava. To se provede následujícím způsobem. Napíše se permutace nalezená při prvním kroku do prvního řádku. Druhý řádek obsahuje tutéž permutaci, ale se všemi ošetřeními posunutými doprava. Ošetření, které bylo nejvíce vpravo, se zapíše do levého volného políčka. Tento postup se zopakuje pro každou řádku tolikrát, aby v každém sloupci byla všechna ošetření, ale pouze jedenkrát.

T3 S3 S, Tz T, Sz

Sz T3 S3 S1 Tz Ti

T, Sz T3 S3 S, Tz

Tz T, Sz T3 S3 S1

S, Tz Ti Sz T3 S3

I Ss I Si I Tz ( T' I- Šz Ts

3. Vygenerují se dvě náhodné permutace čísel 1 až N.' jednu pro řádky

2 3 6 1 4 5

a druhou pro sloupce

3 4 6 2 5 1

5308

4. Latinský čtverec se nyní získá seřazením řádků a sloupců latinského čtverce podle těchto dvou permutací pro řádky a sloupce:

2 3 6 1 4 5

T3 S3 S, Tz T, Sz

Sz T3 S3 S, TZ T,

T, SZ T3 S3 S, Tz

Tz T, Sz T3 S3 S,

S, Tz T, Sa T3 S3

Ts I 3i l - Ti Sz Ts

Tz

1 2 3 4 5 6

S, T3 Tz T, S3 Sz

Sz Tz T3 S3 T, S,

T, S, Sz T3 Tz S3

S3 Sz S, Tz T3 T,

T3 T, S3 S, Sz Tz

Tz I 3s I T1 - Sz Si T3

9 Slovník symbolů

Symbol Definice

a průsečík lineárních regresních přímek závislosti odpovědi na dávce nebo ln dávky

b sklon v modelu lineární regrese závislosti odpovědi na dávce nebo logaritmu dávky, společný pro všechny přípravky ve zkoušce

d počet úrovní dávek pro každý přípravek ve vyvážené zkoušce (bez nulové dávky v modelu sklonu)

e základ přirozených logaritmů (e = 2, 71828182845905...)

g veličina používaná ve Fiellerově větě C_-1

C

h počet přípravků zkoušky včetně standardu

m odhad účinnosti získaný jako podíl efektů v obecném lineárním modelu

n počet opakování každého ošetření

p pravděpodobnost, že daná statistika je větší než pozorovaná hodnota; v probitové analýze je použito též pro podíl r/n

r počet odpovědí na jednotlivá ošetření v kvantáhúch zkouškách

8=

s odhad směrodatné odchylky ( s2 )

sz odhad reziduálního rozptylu určený z analýzy rozptylu

t Studentova testovací statistika (tabulka 8.2)

vi i, viz, vzz rozptyly a kovariance použité ve jmenovateli a čitateli ve Fiellerově větě w váhový koeficient

x logaritmus dávky

y jednotlivá odpověd' nebo transformovaná odpověd

A předpokládaná účinnost použitá pro přípravu dávek zkoušeného přípravku

B průměrná odpověd' na nulovou dávku v modelu sklonu

C statistika užívaná pro výpočet mezí spolehlivosti: , _ 1

1-g

C, , ...C„ průměrná odpověd' v každém sloupci v modelu latinských čtverců

D, , Dz průměrná odpověd' v čase 1 nebo 2 v křížovém pokuse

F podíl nezávislých odhadů rozptylů (tabulka 8.1)

5309

Gs GT efekty ošetřeni v analýze rozptylu pro model poměru sklonů

Hp, HL veličiny použité v analýze rozptylu v modelu rovnoběžnosti

He, H, veličiny použité v analýze rozptylu v modelu poměru sklonů

I v modelu rovnoběžnosti logaritmus poměru sousedních dávek; v modelu poměru sklonů interval mezi sousedními dávkami

Js , JT lineární kontrasty používané v analýze rozptylu pro model poměru sklonů

K korekční faktor používaný k výpočtu součtu čtverců v analýze rozptylu

L šú'ka intervalu spolehlivosti v logaritmech

Ls ...LT lineární kontrasty standardu a zkoušeného přípravku

M' logaritmus účinnosti daného zkoušeného přípravku

N celkový počet odpovědí zkoušky (= d . h)

Ps, Pr součet pro standard a zkoušený přípravek

R odhadovaná účinnosti daného zkoušeného přípravku

R' relativní účinnost daného zkoušeného přípravku

R, ...R„ průměrná odpověd' v každém řádku v modelu latinských čtverců nebo v každém bloku v modelu náhodných bloků

S standardnipřípravek

5, , ., Sd průměrné odpovědi od nejmenší dávky 1 do největší dávky d na standardní přípravek

SS součet čtverců (daného zdroje variability)

T, U, V zkoušené přípravky

T, , ., Td průměrné odpovědi od nejmenší dávky 1 do největší dávky d zkoušeného přípravku T

V variační koeficient používaný pro výpočet mezí spolehlivosti

W statistické váhy používané ke kombinaci výsledků zkoušek

X lineární strukturální matice plánu zkoušky používaná v obecném lineárním modelu

l', Y~ vektor (transformovaných) odpovědí v obecném lineárním modelu Z první derivace

n 3, 141592653589793238...

kumulativní distribuční funkce normálního rozložení (tabulka 8.4)

xz testovací statistika chi-kvadrát (tabulka 8.3)

10 Literatura

Seznam literatury doporučené pro další studium:

Finney, D. J. (1971). Probit analysis, 3`d Ed. Cambridge University Press, Cambridge.

Nelder, J. A. & Wedderburn, R. W. M. (1972). Generalized linear models, Journal of the Royal Statistical Society, Series A 135, 370-384.

Finney D. J. (1978) Statistical Method id Biological Assay, 3`d Ed. Griffm, London.

Sokal, R. R. & Rohlf, F. R. (1981). Biometry: Principles and Practice of Statistics in Biological Research, 2°d Ed. W. H. Freemann & CO, New York.

Peace K. E. (1988). Biopharmaceutical Statistics for Drug Development, Marcel Dekker Inc., New York/Basel.

Bowerman, B. L. & O'Connell, R. T. (1990). Linear Statistical Models an Appleid Approach, 2°n Ed. PWS-KENT Publishing Company, Boston.

Roth Z., Josífico M., Malý V., Trčka V. (1962). Statistické metody experimentální medicíny, Státní zdravotnické nakladatelství.

¹⁾ Wilk, M. B. and Shapiro, S. S. (1968). The joint assessment of normality of several independent samples, Technometrics 10, 825-839.

²⁾ Bartlett, M. S. (1937). Properties of sufficiency and statistical tests, Proc. Roy. Soc. London, Series A 160, 280-282.

³⁾ Cochran, W G. (1951). Testing a linear relation among variances, Biometrics 7, 17-32.