Český lékopis 1997

Estrogena coniugata

2001

Konjugované estrogeny

Synonymum. Estrogeni coniuncti

 

C18H21NaO5S + C18H19NaO5S Mr 372,41 + 370,40  

Jsou to triturace směsi různých konjugovaných forem estrogenů získaných z moči březích klisen nebo syntézou ve vhodném práškovém základu.

Dvě hlavní složky jsou: natrium-17-oxoestra-1,3, 5(10)-trien-3-yl-sulfat1) (natrium-estron-sulfat)2) a natrium-17-oxoestra-1,3, 5(10), 7-tetraen-3-yl-sulfat3) (natrium-ekvilin-sulfat)4). Průvodní látky jsou: natrium-17α-estradiol-sulfat5), natrium-17α-dihydroekvilin-sulfat6) a natrium-17β-dihydroekvilin-sulfat7).

Obsahují 52,5 % až 61,5 % natrium-estron-sulfatu, 22,5 % až 30,5 % natrium-ekvilin-sulfatu, 2,5 % až 9,5 % natrium-17α-estradiol-sulfatu, 13,5 % až 19,5 % natrium-17α-dihydroekvilin-sulfatu, 0,5 % až 4,0 % natrium-17β-dihydroekvilin-sulfatu. Celkový obsah natrium-estron-sulfatu a natrium-ekvilin-sulfatu je 79,5 % až 88,0 %.

Všechna procenta jsou vztažena k obsahu uvedenému v označení na obalu.

Vlastnosti

Téměř bílý až nahnědlý amorfní prášek.

Zkoušky totožnosti

  1. Hodnotí se chromatogramy získané ve Stanovení obsahu. Retenční časy a velikostí dvou hlavních píků odpovídajících estronu a ekvilinu na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídají přibližně dvěma hlavním píkům na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
  2. Hodnotí se chromatogram zkoušeného roztoku (b) získaný ve zkoušce Chromatografický profil, viz Zkoušky na čistotu. Na chromatogramu jsou patrné dodatečné píky odpovídající 17α-estradiolu, 17α-dihydroekvilinu a 17β-dihydroekvilinu, jejichž relativní retenční čas vzhledem k 3-O-methylestronu (vnitřní standard) je asi 0,24,0, 30 a 0, 35.

    Zkoušky na čistotu

    Chromatografický profil. Zkouška se provede způsobem popsaným ve Stanovení obsahu s následujícími dodatečnými informacemi.

    Zkoušený roztok (b). Připraví se zkoušený roztok způsobem popsaným ve Stanovení obsahu, bez přídavku sulfatasy a použije se 6,0 ml horní vrstvy místo 3,0 ml. Stejným způsobem se připraví kontrolní roztok.

    Porovnávací roztok (b).Připraví se porovnávací roztok způsobem popsaným ve Stanovení obsahu. Před přidáním vnitřního standardu se roztok desetinásobně zředí ethanolem R.

    Nastříkne se 1 µl porovnávacího roztoku (a) a měří se plochy píků 17α-dihydroekvilinu, estronu a 3-O-methylestronu s relativním retenčním časem, vzhledem k 3-O-methylestronu, asi 0,30,0, 80 a 1.
    Nastříkne se 1 hl zkoušeného roztoku (a) a určí se píky s relativním retenčním časem, vzhledem k 3-O-methylestronu (1) asi 0,24,0, 29,0, 30,0, 35,0, 56,0, 64,0, 90 a 1,3 a změří se jejich plochy.
    Procentuální obsah složek, vyskytujících se jako soli síranu sodného, se vypočítá podle níže uvedeného vztahu (1).
    Nastříkne se 1 μl porovnávacího roztoku (b) a měří se plochy píků estronu a 3-O-methylestronu s relativním retenčním časem, vzhledem k 3-O-methylestronu, asi 0,80 a l.
    Nastříkne se 1 μl zkoušeného roztoku (b) a určí se píky s relativním retenčním časem, vzhledem k 3-O-methylestronu, asi 0,30,0, 80 a 0, 87 a změří se součet jejich ploch.

    Procentuální obsah 17a-dihydroekvilinu, estronu a ekvilinu, které se vyskytují jako volné steroidy se vypočítá podle vztahu (2):

    S'A · Sl · mR · 137,8 · 1000
    SR · S'l · m · LC
    		 (1),
    S'FS · Sl · mE · 100 · 1000
    SE · S'I · m · LC
    		 (2),

    v nichž značí:

    Sl - plochu píku vnitřního standardu na chromatogramu porovnávacího roztoku,
    S'l - plochu píku vnitřního standardu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
    SR - plochu píku referenční látky (viz tabulka 1) na chromatogramu porovnávacího roztoku,
    S'A - plochu píku analytu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
    mR - navážku porovnávací látky (viz tabulka 1) v miligramech v odpovídajícím porovnávacím roztoku,
    m - navážku zkoušené látky v miligramech v odpovídajícím zkoušeném roztoku,
    S'FS - součet ploch píků 17α-dihydroekvilinu, estronu a ekvilinu na chromatogramu zkoušeného roztoku,
    SE - plochu píku estronu CRL na chromatogramu porovnávacího roztoku,
    mE - navážku estronu CRL v miligramech v odpovídajícím porovnávacím roztoku,
    LC - obsah v miligramech na gram uvedený v označení na obalu.

    Rozmezí procentuálních obsahů:

    natrium-17α-estradiolsulfat: 2,5 % až 9,5 %,
    natrium-17α-dihydroekvilin-sulfat: 13,5 % až 19,5 %,
    natrium-17β-dihydroekvilin-sulfat: 0,5 % až 4,0 %,
    natrium-17β-estradiolsulfat: nejvýše 2,25 %,
    natrium-17α-dihydroekvilenin-sulfat: nejvýše 3,25 %,
    natrium-17β-dihydroekvilenin-sulfat: nejvýše 2,75 %,
    natrium-8, 9-didehydroestron-sulfat: nejvýše 6,25 %,
    natrium-ekvilenin-sulfat: nejvýše 5,5 %,
    celkový estron, ekvilin a 17a-dihydroekvilin: nejvýše 1,3 %.

    Tab. 1

    Relativní retenční čas
    (vzhledem k 3-O-meth lestronu)    		 Látka Referenční látka Přítomný jako
    0,24 17a-estradiol 17a-dihydroekvilin CRL sůl síranu sodného
    0,29 17a-estradiol estron CRL sůl síranu sodného
    0,30 17a-dihydroekvilin 17a-dihydroekvilin CRL volný steroid,
    sůl síranu sodného (stanovení obsahu)
    0,35 17b-dihydroekvilin 17a-dihydroekvilin CRL sůl síranu sodného
    0,56 17a-dihydroekvilenin estron CRL sůl síranu sodného
    0,64 17b-dihydroekvilenin estron CRL sůl síranu sodného
    0,80 estron estron CRL volný steroid,
    sůl síranu sodného(stanovení obsahu)
    0,87 ekvilin ekvilin CRL sůl síranu sodného (stanovení obsahu)
    0,90 8,9-didehydroestron estron CRL sůl síranu sodného
    1 3-O-methylestron vnitřní standard  
    1,3 ekvilenin estron CRL sůl síranu sodného

    Stanovení obsahu

    Provede se plynová chromatografie (2.2.28). za použití 3-O-methylestronu R, jako vnitřního standardu.

    Roztok vnitřního standardu. 8 mg 3-O-methylestronu R se rozpustí v 10,0 ml ethanolu R. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí ethanolem R na 10,0 ml.

    Tlumivý roztok octanový o pH 5,2. 10 g octanu sodného R se rozpustí ve 100 ml vody R a přidá se 10 ml kyseliny octové zředěné RS, zředí se vodou R na 500 ml a pH se upraví na hodnotu 5,2 ±0,1.

    Zkoušený roztok (a). Podle obsahu uvedeného v označení na obalu se převede přesně zvážené množství odpovídající asi 2 mg konjugovaných estrogenů do 50 ml odstřed'ovací zkumavky obsahující 15 ml tlumivého octanového roztoku o pH 5,2 a 1 g chloridu barnatého R. Zkumavka se těsně uzavře a 30 min se třepe. Je-li třeba, pH roztoku se upraví kyselinou octovou R nebo roztokem octanu sodného R (120 g/l) na hodnotu 5,0 ±0,5. Na 30 s se vloží do ultrazvukové lázně a pak se třepe 30 min. Přidá se vhodný sulfatasový přípravek odpovídající 2500 jednotkám a 10 min se třepe mechanicky ve vodní lázni při (50 ±1) °C. Obsah zkumavky se ručně krouživým pohybem promíchá, pak se 10 min třepe mechanicky ve vodní lázni a nechá se ochladit. Ke směsi se přidá 15,0 ml dichlorethanu R, zkumavka se ihned těsně uzavře a třepe se 15 min. Odstřed'uje se 10 min nebo do vyčeření spodní vrstvy. Organická vrstva se převede do zkumavky se šroubovacím uzávěrem a přidá se 5 g síranu sodného bezvodého R a protřepe se. Roztok se nechá stát do vyčeření, při čemž se chrání před ztrátou odpařením.

    3,0 ml čirého roztoku se převede do vhodné odstřed'ovací zkumavky se šroubovacím uzávěrem a přidá se 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Tato směs se odpaří do sucha v proudu dusíku R při teplotě nižší než 50 °C. K vysušenému zbytku se přidá 15 µl pyridinu bezvodého R a 65 μl N, O-bis(trimethylsilyl)trifluoracetamidu R obsahujícího 1 % chlotrimethylsilanu R. Zkumavka se ihned těsně uzavře, opatrně se promíchá a nechá se 15 min stát, pak se přidá 0,5 ml toluenu R a mechanicky se promíchá.

    Porovnávací roztok (a). Rozpustí se odděleně 8 mg estronu CRL, 7 mg ekvilinu CRL a 5 mg 17α-dihydroekvilinu CRL v 10,0 ml ethanolu R. 2,0 ml, 1,0 ml a 1,0 ml těchto roztoků se smíchají a zředí se ethanolem R na 10,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku a 1,0 ml roztoku vnitřního standardu se převedou do odstřed'ovací zkumavky se šroubovacím uzávěrem, odpaří se do sucha v proudu dusíku R při teplotě nižší než 50 °C. K vysušení zbytku se přidá 15 µl pyridinu bezvodého R a 65 µl N, O-bis(trimethylsilyl)trifluoracetamidu R obsahujícího 1% chlotrimethylsilan R. Zkumavka se ihned těsně uzavře, opatrně se promíchá, nechá se 15 min stát a pak se přidá 0,5 ml toluenu R.

    Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

    Teplota kolony se udržuje na 220 °C, nástřikového prostoru a detektoru na 260 °C. Teplota a průtoková rychlost nosného plynu se nastaví tak, aby bylo dosaženo požadovaného rozlišení.
    Nastříkne se 1 μl porovnávacího roztoku (a). Relativní retenční časy 17α-dihydroekvilinu, estronu, ekvilinu a 3-0-methylestronu, vzhledem k 3-O-methylestronu, jsou asi 0,30,0, 80,0, 87 a 1.
    Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky estronu a vnitřního standardu je nejméně 1,2. Relativní směrodatná odchylka poměru ploch píku estronu a vnitřního standardu, získaná z nejméně šesti nástřiků, je nejvýše 2,0 %.
    Nastříkne se 1 μl porovnávacího roztoku (a) a změří se plochy píků estronu nebo ekvilinu a O-methylestronu. Nastříkne se 1 μl zkoušeného roztoku (a) a změří se plochy píků estronu, ekvilinu a 3-O-methylestronu.
    Obsah natrium-estron-sulfatu a natrium-ekvilin-sulfatu v procentech se vypočítá podle vztahu (1).

    Uchovávání

    Chráněn před mrazem.
    Separandum.

    Označování

    V označení na obalu se uvede:

    Nečistoty a průvodní látky

    1. R1 = OH, R2 = H, R3 = SO3Na: natrium-17α-hydroxyestra-1,3, 5(10)-trien-3-yl-sulfat8) (natrium-l7a-estradiol-sulfat)9),
    2. R1 = H, R2 = OH, R3 = SO3Na: natrium-17β-hydroxyestra-1,3, 5(10)-trien-3-yl-sulfat10) (natrium-17β-estradiol-sulfat)11),
    3. R1, R2= O, R3= H: 3-hydroxyestra-1,3, 5(10)-trien-17-on (estron),
    4. R1 = OH, R2 = H, R3 = SO3Na: natrium-l7a-hydroxyestra-1,3, 5(10), 7-tetraen-3-yl-sulfat12) (natrium-17a-dihydroekvilin-sulfat)13),
    5. R1 = H, R2 = OH, R3 = SO3Na: natrium-17(3-hydroxyestra-1,3, 5(10), 7-tetraen-3-yl-sulfat14) (natrium-17R-dihydroekvilin-sulfat)15),
    6. R1, R2= O, R3= H: 3-hydroxyestra-1,3, 5(10), 7-tetraen-17-on (ekvilin),
    7. R1 = OH, R2 = R3 = H: estra-1,3, 5(10), 7-tetraen-3,17a-diol (17a-dihydroekvilin), R1 = OH, R2 = H: natrium-17a-hydroxyestra-1,3, 5(10), 6, 8-pentaen-3-yl-sulfat16) (natrium-l7a-dihydroekvilenin-sulfat)17),
    8. R1 = H, R2 = OH: natrium-17(3-hydroxyestra-1,3, 5(10), 6,8-pentaen-3-yl-sulfat18) (natrium-17(3-dihydroekvilenin-sulfat)19),
    9. R1, R2=O: natrium-17-oxoestra-1,3, 5(10), 6, 8-pentaen-3-yl-sulfat20) (natrium-ekvilenin-sulfat)21),
    10. natrium-17-oxoestra-1,3, 5(10), 8-tetraen-3-yl-sulfat22) (natrium-8,9-didehydroestron-sulfat)23).

    1) natrium-17-oxoestra-1,3, 5(10)-trien-3-yl-sulfát
    2) natrium-estron-sulfát
    3) natrium-l7-oxoestra-1, 3,5(10), 7-tetraen-3-yl-sulfát
    4) natrium-ekvilin-sulfát
    5) natrium-l7α-estradiol-sulfát
    6) natrium-l7α-dihydroekvilin-sulfát
    7) natrium-17β-dihydroekvilin-sulfát
    8) natrium-17a-hydroxyestra-1,3, 5(10)-trien-3-yl-sulfát
    9) natrium-17α-estradiol-sulfát
    10) natrium-17β-hydroxyestra-1,3, 5(10)-trien-3-yl-sulfát
    11) natrium-17β-estradiol-sulfát
    12) natrium-17α-hydroxyestra-1,3, 5(10), 7-tetraen-3-yl-sulfát
    13) natrium-17a-dihydroekvilin-sulfát
    14) natrium-17β-hydroxyestra-1,3, 5(10), 7-tetraen-3-yl-sulfát
    15) natrium-17β-dihydroekvilin-sulfát
    16) natrium-17α-hydroxyestra-1, 3,5(10), 6,8-pentaen-3-yl-sulfát
    17) natrium-17α-dihydroekvilenin-sulfát
    18) natrium-17β-hydroxyestra-1,3, 5(10), 6,8-pentaen-3-yl-sulfát
    19) natrium-17β-dihydroekvilenin-sulfát
    20) natrium-17-oxoestra-1,3, 5(10), 6,8-pentaen-3-yl-sulfát
    21) natrium- ekvilenin-sulfát
    22) natrium-17-oxoestra-1,3, 5(10), 6,8-pentaen-3-yl-sulfát
    23) natrium-8,9-didehydroestron-sulfát