Producta ab ADN recombinante

Připravky vyrobené rekombinantní DNK technologií

Údaje v tomto článku jsou určené pro jednotlivé články v lékopise pojednávající o přípravcích vyrobených rekombinantní DNK technologií (rDNK). Kromě těchto článků není nutné uvedené požadavky dodržovat. Tento článek také není možno aplikovat na modifikované živé organismy používané přímo u lidí a zvířat, např. jako živé vakcíny.

Produkty technologie rDNK vznikají genetickou modifikací, při níž je DNK obsahující kódy pro požadovaný produkt vložena pomocí plazmidů nebo virů jako vektoru do vhodného mikroorganismu nebo buněčné linie, kde nastává exprese DNK a tvorba bílkoviny. Žádaná látka se pak získá extrakcí a čištěním. Buňka nebo mikroorganismus před vložením vektoru je nazývána hostitelskou buňkou a její stabilní spojení s vektorem, používané ve výrobním procesu, se nazývá hostitelsko-vektorový systém.

Výroba

Výroba je založena na validovaném systému jednotné inokulace užívajícím hostitelsko-vektorovou kombinaci, která splňuje požadavky oprávněné autority. Systém jednotné inokulace používá banku základních buněk a banku pracovních buněk, jež se odvozují od základního hostitelsko-vektorového systému. Dále se mají podrobně popsat postupy kultivace, extrakce a čištění a zavést definice výrobní šarže.

Důkaz vhodnosti spojení hostitele s vektorem a validace systému jednotné inokulace zahrnuje následující prvky.

Klonování a exprese

Vhodnost hostitelsko-vektorového systému, zvláště z hlediska mikrobiologické čistoty, se prokáže:

• charakteristikou hostitelské buňky, včetně zdroje, fenotypu a genotypu a média buněčné kultury,
• dokumentací o strategii klopování genu a charakteristice rekombinantního vektoru, která zahrnuje:
  1. původ a charakteristiku genu,
  2. sekvenční analýzu nukleotidů klopovaného genu a kontrolu styčných oblastí vektoru exprese. Klopované sekvence se omezí na minimum a všechny důležité exprimované sekvence se jasně identifikují a ověří na úrovni RNK.

     Sekvence DNK klopovaného genu se běžně ověří na úrovni výchozí kultury až po a případně i nad normální hranici populačního dvojnásobku pro celou stupnici fermentace. V některých systémech, kde např. je mnoho kopií genu vloženo do genomu kontinuální buněčné linie, není vhodné provádět sekvenci klopovaného genu na úrovni výroby. V těchto případech může pomoci "Southern blot" analýza celkové buněčné DNK nebo sekvenční analýza mediátorové RNK (mRNK). Zvláště je nutné věnovat pozornost charakterizaci exprimované bílkoviny,

  3. konstrukci, genetiku a strukturu úplného vektoru exprese.
• charakteristikou hostitelsko-vektorového systému, která zahrnuje:
  1. mechanismus přenosu vektoru do hostitelské buňky,
  2. množství kopií, fyzikální stav a stabilitu vektoru uvnitř hostitelské buňky,
  3. opatření použitá pro podporu a kontrolu exprese.

Systém buněčné banky

Banka základních buněk je homogenní suspenze původních buněk již změněných vektorem exprese, který obsahuje požadovaný gen. Pro skladování (např. v tekutém dusíku) je rozdělena ve stejných objemech do jednotlivých nádob. V některých případech je nutné vytvořit oddělené záklaďní buněčné banky pro vektor exprese a hostitelské buňky.

Banka pracovních buněk je homogenní suspenze buněčného materiálu odvozeného z banky základních buněk na úrovni konečné pasáže. Pro skladování (např. v tekutém dusíku) je rozdělená ve stejných objemech do jednotlivých nádob.

Pro obě buněčné banky platí, že všechny nádoby jsou uchovávány stejným způsobem, a jestliže se jeďnou vyjmou z buněčného skladu, nesmí se tam znovu vrátit.

Buněčná banka může být použita pro výrobu na úrovni konečné pasáže nebo pro výrobu s kontinuální kultivací.

Výroba na úrovni konečné pasáže. Tato kultivační metoda je definována limitujícím počtem pasáží nebo zdvojením populace, které nesmí být při výrobě překročeno. Maximální počet zdvojení buněk nebo úrovní pasáží při rutinním procesu výroby splňuje níže popsaná kritéria.

Výroba s kontinuální kultivací. U této kultivační metody není omezen počet pasáží nebo zdvojení populace uskutečněných od počátku výroby. Kritéria pro výtěžek, jakož i pro ukončení výroby jsou defmovánavýrobcem. Kulturu je nutné během jejího životamonitorovat. Požadovaná frekvence a typ monitorování závisí na povaze výrobního systému a výrobku.

Nutné jsou též informace o molekulární neporušenosti exprimovaného genu a o fenotypové a genotypové charakteristice hostitelské buňky po dlouhodobé kultivaci. Souhlas s výtěžky pro další postup je jasně spojen se schématem požadovaného monitorování. Další postup výroby je také podmíněn jeánoznačnou definicí šarže výrobku.

Validace buněčných bank

Validace buněčných bank obsahuje následující údaje:

1. o stabilitě buňky získané měřením životaschopnosti a schopnosti udržení vektoru,
2. o identitě buněk podle fenotypových vlastností,
3. někdy je nutný důkaz o nepřítomnosti zdrojů potenciálně onkogenních nebo náhodně infekčních činitelů (viry, bakterie, houby nebo mykoplazmata) v buněčných bankách. Zvláštní pozornost se musí věnovat virům, které mohou běžně kontaminovat druhy, ze kterých je buněčná linie odvozena. Některé buněčné linie obsahují endogenní viry, např. retroviry, jejichž odstranění j e nesnadné. Sleduje se proto exprese těchto organismů za různých podmínek, o nichž je známo, že ji mohou indukovat,
4. pro savčí buňky je nutné získat podrobnosti o jejich potenciální schopnosti nádorového bujení.

Kontrola buněk

Za daných podmínek uchovávání a obnovy buněk se pro všechny buněčné banky podrobně dokumentuje původ, forma, uchovávání, použití a stabilita buněk při předpokládaném způsobu použití. Nové buněčné banky se validují v plné míře.

Validace výrobního postupu

Extrakce a čištění

Kapacita každého stupně procesu extrakce a čištění výrobku se validuje vzhledem ke kapacitě odstranění nebo inaktivace kontaminujících látek pocházejících od hostitelské buňky nebo kultivačního média včetně virových částic, bílkovin, nukleových kyselin a přidaných látek.

Validační studie se provádějí tak, aby ukázaly, že výrobní postup běžně splňuje následující kritéria:

• vyloučení cizích látek z výrobku; provedou se studie zahrnující např. viry s odpovídající fyzikálně-chemickou strukturou a zjistí se kapacita snížení těchto kontaminujících látek v každém odpovídajícím stupni čištění,
• přiměřené odstranění vektoru, hostitelských buněk, kultivačního média a kontaminace z chemikálií z výrobku. Kapacita snížení DNK se stanoví metodou záměrné kontaminace. Redukce bílkovin živočišného původu se může stanovit imunochemickými metodami,
• dodržování stanovených limitů výtěžku produktu kultury,
• dostatečná stabilita všech intermediálních produktů anebo přípravy výroby v případě, že se během výroby uvažuje o jejich uchovávání.

Charakteristika látky

Nejprve se ověří totožnost, čistota, účinnost a stabilita konečné várky produktu pomocí širokého spektra chemických, fyzikálních, imunochemických a biologických zkoušek. Před propuštěním výrobce každou šarži výrobku kontroluj e na totožnost a čistotu a provede vhodné stanovení obsahu.

Pravidelnost výroby

Provedou se vhodné zkoušky dokládající pravidelnost výroby a čištění. Jsou to zvláště charakteristické zkoušky, prováděné mezioperační zkoušky a zkoušky prováděné u konečného výrobku, jako např.:

• složení aminokyselin;
• částečná aminokyselinová sekvenční analýza. Sekvenční data umožňují potvrdit správnost N-terminálního zpracování a detekují ztrátu C-terminálních aminokyselin;
• mapování peptidů. Chemické nebo enzymatické štěpení bílkovinného produktu a analýza peptidů vhodnou metodou, jako jsou dvourozměrná gelová elektroforéza, kapilární elektroforéza nebo kapalinová chromatografie, neukáže žádné významné rozdíly mezi zkoušenoli bílkovinou a referenčním přípravkem. Peptidové mapování může být též použito pro důkaz správných disulfidických vazeb;
• stanovení molekulové hmotnosti;
• udržení klopovaného genu. Minimální procentuální podíl buněk po kultivaci obsahujících vektor nebo klopovaný gen je stanoven oprávněnou autoritou;
• celková bílkovina. Stanoví se výtěžek bílkovin;
• chemická čistota. Čistota bílkovinného přípravku se analyzuje vhodnými metodami, jako je kapalinová chromatografie, kapilární elektroforéza nebo polyakrylová gelová elektroforéza s dodecylsíranem sodným v porovnání s referenčním přípravkem.
• bílkoviny hostitelské buňky. Pokud není předepsáno jinak, prokazují se bílkoviny hostitelské buňky imunochemickými metodami, např. pomocí polyklonálních antisér proti bílkovinám hostitelsko-vektorového systému používaného při výrobě přípravku. Mohou se použít následující typy metod: metody vytěsnění v kapalinové fázi (např. radioimunoanalýza), metody přímé vazby v kapalinové fázi a metody přímé vazby pomocí antigenu imobilizovaného na nitrocelulosových (nebo podobných) membránách (např. metoda dot-imunoblot, Western blot). Všeobecné požadav ky pro validaci imunochemických metod jsou uvedeny v článku Imunochemické metody (2. 7.1). Navíc musí imunochemické metody pro stanovení kontaminace hostitelské buňky vyhovovat následujícím požadavkům:
• antigenní přípravky. Antiséra jsou vytvořena proti antigenům připraveným z hostitelského organismu použitého při výrobě, do kterého byl vložen vektor postrádající specifický gen kódující žádanou látku. Tato hostitelská buňka se kultivuje a bílkoviny se extrahují za stejnýcli podmínek kultivace a extrakce jako při výrobě. Pro přípravu antiséra je možno též použít antigeny částečně vyčištěné některým z procesů čištění používaným při výrobě;
• kalibrace a standardizace. Kvantitativní údaje se stanoví porovnáním kalibračních křivek vyjadřujících závislost odpovědi na dávce s použitím referenčních přípravků antigenů hostitelských bílkovin. Protože tyto přípravky jsou směsí špatně definovaných bílkovin, referenčnli přípravek se připraví a kalibruje vhodnou metodou pro stanovení bílkovin. Tento přípravek se uchovává ve vhodném stabilním stavu, který umožňuje jeho použití v delším časovém období;
• antíséra. Mají mít vysokou aviditu u protilátek schopných ve směsi antigenů rozpoznat tolik různých bílkovin, kolik je možné, a nedávají vedlejší reakce s výrobkem;
• DNK pocházející z hostitelské buňky nebo vektoru. Zbytková DNK se zjišťuje hybridizační analýzou pomocí vhodně citlivé analytické metody nezávislé na sekvenci nebo jinou dostatečně citlivou analytickou metodou.

Hybridizační analýza

Ve zkoušeném vzorku je DNK denaturována na jednovláknovou DNK, imobilizuje se na membráně z nitrocelulosy nebo jiné vhodné membráně a hybridizace se se značenou DNK připravenou z výrobního hostitelsko-vektorového systému (sonda DNK). V rámci široké možnosti experimentálních přístupů pro stanovení hostitelsko-vektorové DNK mají všechny hybridizační metody splňovat následující kritéria:

• sondy DNK. Čištěná DNK se získá z hostitelsko-vektorového systému rostoucího ve stejných podmínkách jako při výrobě. Také se mohou použít vzorky hostitelské chromozomální DNK a vektorové DNK připravené odděleně;
• kalibrace a standardizace. Kvantitativní údaje se získají porovnáním s odpověďmi získanými při použití referenčních přípravků. Pro sondy chromozomální DNK a sondy vektorové DNK se použijí referenční přípravky chromozomální DNK a vektorové DNK. Referenční přípravky sli kalibrují spektrofotometricky a uchovávají se ve vhodném stabilním stavu, který umožňuje používání po delší časové období;
• podmínky hybridizace. Přísnost hybridizačních podmínek zajišťuje specifickou hybridizaci mezi sondami a referenčním přípravkem DNK. Přípravek v použité koncentraci nesmí interferovat s hybridizací.

Metody nezávislé na sekvenci Vhodné metody zahrnují:

1. detekci sulfonylovaného cytosinového zbytku v jednovláknové DNK (kde DNK je imobilizována na filtru a cytosiny jsou derivatizovány in situ před detekcí a kvantitativním stanovením pomocí protilátek proti sulfonové skupině),
2. detekci j ednovláknové DNK pomocí fragmentu j ednovláknové DNK vázaného na bílkovinu a protilátky proti této bílkovině. Žádný z těchto postupů nepožaduje použití specifické hostitelské nebo vektorové DNK jako referenčního přípravku pro stanovení. Nicméně se tato metoda validuj e, aby se zajistil rovnoběžný průběh s použitým referenčním přípravkem DNK, linearita odpovědi a to, že přípravek nebo pomocné látky nebudou v použité koncentraci interferovat.

Zkoušky totožnosti, zkoušky na čistotu, stanovení obsahu

Požadavky na konečný výrobek (konečná várka nebo léková forma), kterým vyhovuje po dobu použitelnosti, jakož i specifické zkušební metody jsou uvedeny v jednotlivých článcích.

Uchovávání

Viz jednotlivé články.

Označování

Viz jednotlivé články.