Immunoglobulinum humanum rabicum

Lidský imunoglobulin proti vzteklině

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště immunoglobulin G. Přípravek je určen pro intramuskulární podání. Vyrábí se z plazmy dárců imunizovaných proti vzteldině. Obsahuje specifické protilátky neutralizující rabický virus. Může se přidat normální lidský imunoglobulin odpovídající článku Immunoglobulinum humanum normale.

Přípravek vyhovuje požadavkům uvedeným v článku Immunoglobulinum humanum normale s výjimkou minimálního počtu dárců a minimálního obsahu celkových bílkovin.

Stanovení účinnosti.

Účinnost se stanoví porovnáním dávky imunoglobulinu potřebné k neutralizaci infekčnosti suspenze rabického viru s dávkou referenčního přípravku, kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, potřebnou k dosažení téhož stupně neutralizace (2. 7.1 Imunochemické metody). Zkouška se provádí na citlivých buněčných kulturách a přítomnost viru, který není zneutralizován, se prokáž e imunofluorescencí.

Mezinárodní jednotka je specifická neutralizační účinnost proti rabickému viru obsažená v deldarovaném množství mezinárodního standardu lidského imunoglobulinu proti vzteldině. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Zkouška se provede na vhodných citlivých buňkách. Obvykle se používají buňky buněčné linie BHK 21, rostoucí v médiu popsaném dále, mezi 18. a 30. pasáží od ATCC inokula. Buňky se sklízejí po 2 až 4 dnech růstu, uvolňují se trypsinem a připraví se suspenze obsahující 500 000 buněk v mililitru (buněčná suspenze). Je-li třeba, 10 min před použitím suspenze se přidá 10 µg diethylaminoethyldextranu R na mililitr ke zvýšení citlivosti buněk.

Použije se stálý virový kmen rostoucí na citlivých buňkách, jako je např. kmen CVS viru rabies adaptovaný na růst na buňkách linie BHK 21 (inokulační virová suspenze). Metodou popsanou dále se stanoví titr inokulační virové suspenze.

Připraví se sériová ředění virové suspenze. Do komůrek na sklech pro tkáňové lazltury (8 komůrek na slilo) se nakape po 0,1 ml každého ředění a 0,1 ml média a přidá se 0,2 ml buněčné suspenze. Inkubuje se 24 h v atmosféře oxidu uhličitého při 37 °C. Po fixaci a imunofluorescenčním barvení se skla vyhodnotí. Stanoví se konečný bod titrace inokulační virové suspenze a připraví se pracovní ředění viru, které v 0,1 ml obsahuje 100 CCID 50.

Pro každou zkoušku se ověří množství použitého viru provedením kontrolní titrace: z ředění odpovídajícího 100 CCIDso v 0,1 ml se připraví tři desetinásobná ředění. Po 0,1 ml každého ředění se nakape do čtyř komůrek obsahujících 0,1 ml média a přidá se po 0,2 ml buněčné suspenze. Zkouška je platná, když titr leží mezi 30 CCIDso a 300 CCIDso.

Referenční přípravek se zředí neobohaceným médiem na koncentraci 2 m.j. v mililitru (zásobní referenční ředění; uchovává se při teplotě nižší než -80 °C). Připraví se dvě vhodná předředění (1 : 8 a 1 : 10) ze zásobního referenčního ředění tak, aby ředění referenčního přípravku, které sníží počet fluoreskujících poli 0 50 %, bylo v rozsahu čtyř ředění na lazltivačním slde. Přidá se 0,1 ml média do všech komůrek s výjimkou prvních ve dvou řadách, do kterých se případně přidá 0,2 ml ze dvou předředění zásobního referenčního ředění postupným přenášením 0,1 ml do dalších komůrek.

Zkoušený přípravek se zředí v poměru 1 : 100 neobohaceným médiem (zásobní ředění imunoglobulinu), aby se snížily na minimum chyby způsobené viskozitou neředěného přípravku. Připraví se tři vhodná předředění tak, aby ředění zkoušeného přípravku, které sníží počet fluoreslazjících polí 0 50 %, bylo v rozsahu čtyř ředění na lazltivačním skle. Přidá se 0,1 ml média do všech komůrek s výjimkou prvních ve všech třech řadách, do nichž se přidá 0,2 ml ze tří předředění zásobního ředění imunoglobulinu. Připraví se řada dvojnásobných ředění postupným přenášením 0,1 ml do dalších komůrek.

Do všech komůrek obsahujících ředění referenčního přípravku a ředění zkoušeného přípravku se přidá 0,1 ml virové suspenze odpovídající 100 CCID so v 0,1 ml (pracovní ředění viru), protřepe se v ruce a inkubuje se 90 min v atmosféře oxidu uhličitého při 37 °C. Přidá se 0,2 ml buněčné suspenze, protřepe se v ruce a inkubuje 24 h v atmosféře oxidu uhličitého při 37 °C.

Po 24 h se odstraní médium a sejmou se plastové stěny. Buněčný monolayer se promyj e tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,4 a směsí objemových dílů vody R a acetonu R (20 + 80). Fixuje se 3 min směsí objemových dílů vody R a acetonu R (20 + 80) při -20 °C. Na skla se nanese fluorescein-konjugované rabické antisérum R. Ponechá se 30 min při 37 °C v prostoru s vysokou vlhkostí. Promyje se tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,4 a usuší se. Vyšetří se dvacet polí v každé komůrce mikroskopem se zařízením pro fluorescenci při zvětšení 250x. Zaznamenává se počet polí s nejméně jednou fluorescenčně označenou buňkou. Přepočítá se zkoušená dávka použitá při titraci viru a stanoví se ředění referenčního přípravku a ředění zkoušeného přípravku, které snižuje počet fluorescenčních poli 0 50 %. Ředění se spočítá ze dvou nebo tří ředění společně použitím probitové analýzy. Zkoušku lze hodnotit pouze tehdy, jestliže statistická analýza nevykazuje signifikantní odchylku od křivky dávka - odpověď a odchylku od linearity nebo rovnoběžnosti.

Deklarovaná účinnost je nejméně 150 m.j. v mililitru. Stanovená účinnost není menší než deklarovaná účinnost a není větší než dvojnásobek deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P= 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 80 % a nejvýše 125 %.

Médium pro růst buněk BHK 21

Komerčně vyráběná média, která mají pouze malé odchylky od dále uvedeného média, se mohou také použít.

Médium se doplňuje:

Uchovávání

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

Označování

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

V označení na obalu se uvede počet mezinároďních jeďnotek v balení.