Český lékopis 1997

Vaccinum influenzae equi inactivatum

1998

Inaktivovaná vakcína proti chřipce koní

Je to přípravek z jednoho nebo více vhodných kmenů virů chřipky koní, inaktivovaných takovým způsobem, aby se zachovala imunogenní účinnost. Vhodné jsou kmeny, které obsahují hemaglutinin a neuraminidázu.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Každý kmen viru se pomnoží odděleně v kuřecích embryích pocházejících ze zdravého chovu nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Virové suspenze se mohou purifikovat a koncentrovat. Obsah antigenu ve vakcíně se zakládá na obsahu hemaglutininu, jehož obsah ve virové suspenzi se stanovuje způsobem popsaným v odstavci Mezioperační zkoušky. Množství hemaglutininu u každého kmene není menší než množství ve vakcíně, která vykázala vyhovující výsledek ve zkoušce účinnosti.

Zkouška na zbytkovou infekčnost viru chřipky se provede bud' metodou A, nebo metodou B, podle toho, která z nich je citlivější. Množství použitého inaktivovaného viru odpovídá nejméně deseti dávkám vakcíny.

  1. Vakcína se očkuje na vhodné buňky. Po osmidenní inkubaci se provede přeočkování. Inkubuje se dalších 6 až 8 dnů. Odebere se 0,1 ml supernatantu a hemaglutinační zkouškou se ověřuje přítomnost živého viru. Jestliže byla zjištěna hemaglutinace, provede se další pasáž na buněčné kultuře a zkouška hemaglutinace. Nesmí být zjištěna hemaglutinace.
  2. Do alantoidní dutiny každého z deseti kuřecích embryí se očkuje 0,2 ml vakcíny. Inkubuje se 3 až 4 dny při 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit, pokud přežije nejméně osm z deseti embryí. Z každého živého embrya se odebere 0,5 ml alantoidní tekutiny a vytvoří se směs. Do dalších deseti kuřecích embryí se očkuje po 0,2 ml směsné alantoidní tekutiny a inkubují se 3 až 4 dny při 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit, pokud přežije nejméně osm z deseti embryí. Z každého živého embrya se odebere 0,1 ml alantoidní tekutiny a každý jednotlivý odběr se vyšetří na živý virus hemaglutinační zkouškou. Jestliže byla zjištěna hemaglutinace u některého vzorku alantoidní tekutiny, provede se další pasáž této alantoidní tekutiny na kuřecích embryích a zkouška hemaglutinace. Nesmí být zjištěna hemaglutinace.

    Vakcína může obsahovat vhodné adjuvans.

Výběr složení vakcíny

Výběr kmenů použitých k přípravě vakcíny vychází z epidemiologické situace.

O.I.E. (Mezinárodní úřad pro nákazy zvířat) pravidelně kontroluje epidemiologické údaje, a jeli třeba, doporučuje nové odpovídající kmeny, které převažují při epidemiologických zjištěních. Tyto kmeny jsou použity v souladu se směrnicí a v působnosti států, které podepsaly Úmluvu o vypracování Evropského lékopisu.

Vakcína prokazatelně odpovídá z hlediska bezpečnosti a imunogenity na koních. Pokud je o nějakém plemenu koní známo, že je zvláště citlivé na tuto vakcínu, jsou do zkoušek bezpečnosti zahrnuti také koně z tohoto plemene. K prokázání bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2. 7) se mohou použít následující zkoušky.

Bezpečnost. Zkouška se provádí všemi doporučenými způsoby na takové kategorii zvířat, pro kterou je vakcína určena.

Nejméně deseti zvířatům se předepsaným způsobem vstříknou dvě dávky vakcíny. Po čtrnácti dnech se každému zvířeti podá jedna dávka vakcíny. Zvířata se pozorují dalších čtrnáct dnů. Během osmadvacetidenního zkoušení se nezjistí žádné nadměrné místní nebo systémové reakce. Je-li vakcína určena pro březí klisny, jsou klisny vakcinovány během náležitého trimestru nebo trimestrů březosti a období pozorování se prodlouží až do doby porodu. Nezjistí se žádný vliv na březost ani na potomstvo.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k průkazu imunogenity kmenů obsažených ve vakcíně.

Čelenž s virulentním kmenem se provede nejméně proti jednomu z kmenů obsažených ve vakcíně. Imunogenita ostatních kmenů obsažených ve vakcíně se může prokázat na základě sérologické odpovědi vyvolané po vakcinaci koní. Oprávnění k ochraně proti těmto kmenům může být založeno na publikovaných údajích o vztahu mezi turem protilátek a ochranou proti kmenům antgnně příbuzným.

Je-li použita sérologie, provádí se zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti, ale místo virulentní čelenže se za dva týdny po poslední vakcinaci odeberou vzorky krve a vhodnými imunochemickými metodami (2.7.1), jako jsou jednoduchá radiální hemolýza nebo hemaglutinač ně inhibiční test - jak je uvedeno dále -, se stanoví u každého séra titr protilátek. K validaci zkoušky se používá referenční sérum. Podmínky pro přijetí závisí na kmenu a jsou založeny na dosažitelných údajích; pro kmen viru A/equi-2 jsou zpravidla vakcíny dostačující, jestliže titr protilátek každého séra (při vyšetření jednoduchou radiální hemolýzou) není menší než 85 mmZ. Jestliže se použije hemaglutinačně inhibiční test, nemá být titr nižší než 64 (před smícháním se suspenzí antigenu a erytrocytů).

Požadavky na výrobek vyjadřují druh prokázané imunogenity (chráněnost proti čelenži nebo tvorba protilátek).

Jednoduchá radiální hemolýza. Sérum se 30 min zahřívá na 56 °C. Zkouší se každé sérum s použitím antigenu nebo antigenů připravených z kmenů použitých při výrobě vakcíny. Smíchá se 1 ml suspenze objemových dílů ovčích erytrocytů v tlumivém roztoku barbitalovém (1 objemový díl erytrocytů do 10 objemových dílů imální suspenze) s 1 ml vhodného ředění kmene viru chřipky v tlumivém roztoku barbitalovém. Směs se inkubuje 30 min při 4 °C. Ke 2 ml směsi viru a erytrocytů se přidá 1 ml roztoku chloridu chromitého (hexahydrát) R (3 g/l), promíchá se a nechá se 10 min stát. Senzibilizované erytrocyty se zahřejí na 47 °C ve vodní lázni. Smíchá se 15 ml roztoku agarosy R (10 g/l) v tlumivém roztoku barbitalovém, 0,7 ml suspenze senzibilizovaných erytrocytů a vhodné množství ředěného morčecího komplementu v tlumivém roztoku barbitalovém při 47 °C. Směs se vyleje do Petriho misek a doplní se agar. Do vrstvy agaru se vykrojí jamky a do každé jamky se odpipetuje Spl neředěného zkoušeného nebo kontrolního séra. Misky se inkubují 18 h při 37 °C. Měří se průměr zóny hemolýzy a vypočítá se její plocha, která vyjadřuje titr protilátek ve čtverečních milimetrech.

Hemaglutinačně inhibiční test. Sérum se 30 min inaktivuje při 56 °C. K jednomu objemovému dílu každého séra se doplní tři objemové díly tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným o pH 7,4 a čtyři objemové díly suspenze kaolinu lehkého R (250 g/l) ve stejném tlumivém roztoku. Každá směs se třepe 10 min, odstředí se, oddělí se supernatant, který se smíchá s koncentrovanou suspenzí kuřecích erytrocytů. Inkubuje se 60 min při 37 °C a odstředí se. Dosáhne se tak ředění séra 1 : 8. Ke zkoušení sér se použije antigen připravený z kmenů použitých k výrobě vakcíny. Z každého zředěného séra se připraví řada dvojnásobných ředění. K 0,025 ml každého ředění séra se přidá 0,025 ml suspenze antigenu ošetřeného etherem R a obsahující čtyři hemaglutinační jednotky. Směs se nechá 30 min stát a přidá se 0,05 ml suspenze kuřecích erytrocytů obsahující 2 x 10' erytrocytů v 1 ml. Nechá se 1 h stát a zaznamená se poslední ředění séra, ve kterém ještě došlo k úplné inhibici hemaglutinace.

Mezioperační zkoušky

Obsah hemaglutininu v suspenzi inaktivovaného viru po purifikaci a koncentraci, kde je to možné, se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), jako je jednoduchá radiální imunodifuze, s použitím vhodných referenčních přípravků hemaglutininu. Obsah se pohybuje v rozmezí limitů, u nichž se prokázalo, že dovolují přípravu vyhovující vakcíny. U vakcín vyráběných na kuřecích embryích se ke kontrole výroby stanovuje u sklizeného viru obsah bakteriálních endotoxinů.

Zkoušení šarže.

Zkoušku popsanou v odstavci Stanovení účinnosti není nezbytné provádět při běžném zkoušení jednotlivých šarží vakcíny. Provádí se s danou vakcínou jednou nebo vícekrát podle dohody nebo rozhodnutí oprávněné autority. Pokud se tato zkouška neprovádí, použ~e se vhodná platná náhradní metoda. Podmínkou jejího použití je porovnání s šarží vakcíny, která dala vyhovující výsledek ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti. Mohou se použít následující zkoušky.

Zkouška účinnosti šarže. Každému z pěti morčat prostých specifických protilátek se podkožně podá jedna dávka vakcíny. Za 21 dnů se odeberou vzorky krve a oddělí se sérum. Provedou se zkoušky se sérem na přítomnost specifických protilátek vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), např. jednoduchou radiální hemolýzou nebo inhibicí hemaglutinace s použitím referenčního séra k validaci zkoušky. Titr protilátek není významně nižší než titr získaný od morčat, kterým byla podána referenční vakcína s prokazatelně dostatečnou účinností na koních.

Zkouška totožnosti

Vakcína u vnímavých zvířat podněcuje tvorbu specifických protilátek.

    Zkoušky na čistotu

    Bezpečnost. Nejméně dvěma koňům se vstříkne doporučeným způsobem dvojnásobek vakcinační dávky. Každému zvířeti se po 14 dnech podá další jedna dávka. Zvířata se pozorují dalších 10 dnů; zůstanou v dobrém zdravotním stavu a neprojevují se nadměrné místní ani systémové reakce.

    Inaktivace. Do alantoidní dutiny deseti kuřecích embryí se naočkuje po 0,2 ml vakcíny a embrya se inkubují 3 až 4 dny při teplotě 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit, pokud přežije nejméně osm z deseti embryí. Z každého embrya, které přežilo, se odebere 0,5 ml alantoidní tekutiny a připraví se směsný vzorek. Dalším deseti kuřecím embryím se naočkuje po 0,2 ml směsi alantoidní tekutiny a inkubují se 3 až 4 dny při 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit, pokud přežije nejméně osm z deseti embryí. Z každého embrya, které přežilo, se odebere 0,1 ml alantoidní tekutiny a každý vzorek se hemaglutinační zkouškou vyšetří na přítomnost živého viru. Jestliže se u některého vzorku zjistí pozitivní hemaglutinace, provede se s tímto vzorkem další pasáž na kuřecím embryu a zkouška hemaglutinace. Nezjistí se hemaglutinace.

    Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

    Stanovení účinnosti.

    Stanovení účinnosti se provede čelenží s kmenem, proti němuž podle označení má vakcína zajistit ochranu. Pokud je to možné, použ~e se čerstvý izolát.

    Použije se deset koní, ve stáří nejméně 6 měsíců, bez specifických protilátek proti viru chřipky koní. Každému zvířeti se odebere krev a jednotlivě se přezkouší na protilátky proti viru chřipky koní, aby se ověřila séronegativita. Šest zvířat se vakcinuje podle doporučeného schématu. Za 7 dnů po první vakcinaci se u každého zvířete provede druhý odběr krve a zkouška na protilátky proti chřipce koní k anamnestickému určení sérologické odpovědi. Sérologicky pozitivní kusy jsou v tomto stadiu vyřazeny z pokusu. Nejméně za dva týdny po poslední vakcinaci se deseti zvířatům podá aerosolem virus chřipky koní v množství, které u vnímavých zvířat vyvolá charakteristické příznaky onemocnění - např. horečku, výtok z nosu a kašel. Zvířata se pozorují 14 dnů. Denně se od každého zvířete provádějí výtěry z nosu k izolaci viru. Vakcinovaná zvířata mají lehké příznaky, zatímco kontrolní zvířata mají charakteristické příznaky onemocnění. Průměrný počet dnů, ve kterých je virus vylučován, jakož i titr viru jsou významně nižší u vakcinovaných zvířat než u zvířat kontrolních.

    Uchovávání

    Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

    Označování

    Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. V označení na obalu se uvede: