2.6.15 Aktivátor prekalikreinu.

Podstata zkoušky. Aktivátor prekalikreinu aktivuj e štěpení prekalikreinu na kalikrein. Štěpí též chromofor ze syntetického polypeptidického substrátu a rychlost štěpení je měřitelná spektrofotometricky. Koncentrace zkoušeného přípravku se vypočítá porovnáním s referenčním přípravkem kalibrovaným v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v určitém množství mezinárodního standardu, který pozůstává z lyofilizovaného aktivátoru prelcalilcreinu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Příprava substrátu prekalikreinu. Krev nebo plazma pro přípravu prekalikreinu může přít do styku pouze s plastem nebo sklem, jehož povrch je silikonovaný, čímž se zabrání aktivaci srážení. Devět objemových dílů lidské krve se smíchá s 1 objemovým dílem antikoagulačního roztoku (ACD, CPD nebo roztoku citronanu sodného R, 38 g/l), do kterého se přidá 1 mg hexadimethriniumdibromidu R na 1 ml. Po odstředění směsi při 3600 g/l po dobu 5 min se odděli plazma a znovu se 20 min odstřed'uje při 6000 g~ aby sedimentovaly destičky. Po oddělení se plazma chudá na destičky 20 h dialyzuje proti desetinásobnému objemu tlumivého roztoku A. Dialyzovaná plazma se nanese na chromatografickou kolonu obsahující agarosu-DERE pro výměnnou iontovou chromatografii R. Agarosa se nejprve uvede do rovnováhy s tlumivým roztokem A. Objem nabobtnalého gelu je dvakrát větší než objem plazmy. Eluce z kolony tlumivým roztokem A probíhá rychlostí 20 mUcm2/h. Eluát se shromažďuje do frakcí a zaznamenává se jejich absorbance při 280 nm (2.2.25). Spojují se a zachycují frakce, které obsahují bílkovinu zobrazenou na záznamu jako první pík. Jejich objem je asi 1,21crát větší než objem plazmy chudé na destičky. Spojený objem substrátu se zkouší na nepřítomnost aktivity kalikreinu tak, že se 1 objemový díl smíchá s 20 objemovými díly předehřátého roztoku chromogenního substrátu, jenž se použije při stanovení, a směs se inkubuje 2 min při 37 °C. Substrát je vhodný, jestliže vzrůst absorbance za minutu je menší než 0,001. Ke spojenému objemu substrátu se přidá chlorid sodný R (7 g/l) a filtruje se membránovým filtrem (o velikostí porů 0,45 µm). Filtrát se rozdělí na části, které se dají zmrznout, a uchovávají při -25 °C. Substrát se může též lyofilizovat.

Postup od začátku chromatografie po zmrazení v rozdělených částech se provede v průběhu jednoho pracovního dne.

Postup zkoušky. Stanovení je výhodné provádět na automatickém enzymovém analyzátoru při 37 °C a nastavit objemy, koncentrace substrátů a inkubační doby tal~, aby rychlost reakce probíhala lineárně alespoň do 35 m.j./ml. Porovnávací roztoky, zkoušené roztoky a substrát prekalikreinu se, je-li to nutné, mohou ředit tlumivým roztokem B.

Zředěné porovnávací roztoky nebo zkoušené roztoky se 10 min inkubují se substrátem prekalikreinu. Je nutné, aby objem nezředěného vzorku nebyl vyšší než 1/10 celkového objemu inkubační směsi. Tím se vyloučí chyby způsobené změnami iontové síly a pH inkubační směsi. Směs neb o její část se inkubuje s nejméně stejným objemem roztoku vhodného syntetického chromogenního substrátu, o kterém je známo, že je specifický pro kalikrein (např. N-benzoyl-[rprolyl-Ufenylalanyl-L-arginyl-(4-nitrofenyl)amoniumacetat R nebo D prolyl-L fenylalanyl-L-arginin-4-nitroanilid dihyd-rochloridu R), rozpuštěného v tlumivém roztoku B. Zapisuje se rychlost změny absorbance za minutu po dobu 2 min až 10 min při vlnové délce specifické pro použitý substrát. Pro každou směs zkoušeného nebo referenčního přípravku se připraví kontrolní tekutina, která místo substrátu prekalikreinu obsahuje tlumivý roztok B.

Zjištěné změny absorbance za minutu se korigují odečtením odpovídající změny absorbance za minutu u kontrolní tekutiny. Pro referenční přípravek se vynese kalibrační křivka, která zobrazuj e

Závislost korigovaných výsledků změny absorbance za minutu na koncentracích. Tato křivka se použije pro stanovení účinnosti prekalikreinového aktivátoru ve zkoušeném vzorku.

Tlumivý roztokA

Trometamol R 6,055 g

Chlorid sodný R 1,17 g

Hexadimethriniumdibromid R 50 mg

Azid sodný R 0,100 g

Chemikálie se rozpustí ve vodě R, pH roztoku se upraví kyselinou chlorovodíkovou 2 mol/l RS na 8,0 a zředí se vodou R na 1000 ml.

Tlumivý roztokB

Trometamol R 6,055 g

Chlorid sodný R 8,77 g

Chemikálie se rozpustí ve vodě R, pH roztoku se upraví kyselinou chlorovodíkovou 2 mol/l R~S na 8,0 a zředí se vodou R na 1000 ml.