Chymotrypsinum¹⁾

2000

Chymotrypsin

Je to proteolytický enzym získaný aktivací chymotrypsinogenu extrahovaného z hovězích slinivek (Bos taurus L.). Jeho účinnost je nejméně 5,0 mikrokatalů v miligramu. Nejvyšší účinnost je v roztoku při hodnotě pH asi 8; pň hodnotě pH 3 je účinnost revercibilně snížena, ale látka je nejstabilnější.

Výroba

Kde je to vhodné, vyhovuje článku Producta cum possibili transmissione vectorium encephalopathiarum spongiformium animalium.

Zvířata, ze kterých se chymotrypsin získává, musí splíáovat požadavky oprávněné autority na zdraví zvířat určených pro konzumaci lidmi.

Musí se dokázat, v jakém rozsahu dovolí výrobní postup inaktivaci nebo odstranění jakékoliv kontaminace viry nebo jinými původci infekce.

Metoda výroby se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude výrobek zkoušen, vyhoví následující zkoušce.

Histamin (2.6.10). Nejvýše 1 Fug na S mikrokatalů chymotrypsinové účinnosti, počítáno jako histaminová báze. Před stanovením se zkoušený roztok zahrivá 30 min na vodní lázni.

Vlastnosti

Bílý krystalický nebo amorfní prášek. Je mírně rozpustný ve vodě. Amorfní forma je hygroskopická.

Zkoušky totožnosti

1. 1 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se zředí vodou R na 10 ml. Na bílé kapkovací destičce se smíchá v jamce 0,05 ml tohoto roztoku s 0,2 ml roztoku substrátu; vzniká fialově červené zbarvení.

   Roztok substrátu pro zkoušky totožnosti. K 24,0 mg acetyltyrosinethylesteru R se přidá 0,2 ml lihu 96% R a míchá se až do rozpuštění. Přidají se 2,0 ml tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 7,0 (0,067 mol/l), 1 ml červeně methylové směsného indikátoru RS a směs se zředí vodou R na 10,0 ml.

2. 0,5 ml roztoku S se zředí vodou R na 5 ml. Přidá se 0,10 ml roztoku tosylfenylalanylchlormethanu R (20 g/l) v lihu 96% R, upraví se pH na hodnotu 7,0 a 2 h se třepe. V jamce bílé kapkovací destičky se smíchá 0,05 ml tohoto roztoku s 0,2 ml roztoku substrátu, viz Zkouška totožnosti A; do 3 min nevznikne žádné zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 0,10 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 10,0 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S neopalizuje intenzívněji než porovnávací suspenze II (2.2.1).

Hodnota pH (2.2.3). 3,0 až 5,0; měří se roztok S.

Absorbance (2.2.25). 30,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,001 mol/l RS a zředí se jí na 100,0 ml. Roztok vykazuje absorpční maximum při 281 nm a minimum při 250 nm. Specifická absorbance v maximu je 18,5 až 22,5 a v minimu není větší než 8.

Trypsin. Do jamky bílé kapkovací destičky se přidá 0,05 ml tlumivého roztoku trometamolového o pH 8,1 a 0,1 ml roztoku S. Ke směsi se přidá 0,2 ml roztoku substrátu (zkoušený roztok). Současně a za stejných podmínek se připraví porovnávací roztok obsahující zkoušenou látku, ke které bylo přidáno nejvýše 1 % trypsinu BRP. Měří se čas; zkoušený roztok se během 3 min až 5 min po přidáni roztoku substrátu nezbarví. Porovnávací roztok se zbarví fialově červeně. Roztok substrátu. K 98,5 mg tosylargininiummethylesterchloridu R vhodného pro stanovení trypsinu se přidá 5 ml tlumivého roztoku trometamolového o pH 8,1 a míchá se do rozpuštění. Potom se přidá 2,5 ml červeně methylové směsného indikátoru RS a zředí se vodou R na 25,0 ml.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 5, 0 %; 0,100 g se suší 2 h při 60 °C při tlaku nepřesahujícím 0,7 kPa.

Stanovení účinnosti.

Účinnost se stanoví porovnáním rychlosti, s jakou hydrolyzuje zkoušená látka acetyltyrosinethylester R, s rychlostí, s jakou hydrolyzuje chymotrypsin BRP za stejných podmínek stejný substrát.

Přístrojové vybavení. Použije se reakční nádobka o objemu asi 30 ml vybavená:

• zařízením udržující teplotu při (25,0 f 0,1) °C,
• míchadlem, např. elektromagnetickým,
• víkem s otvory pro elektrody, byretu, přívod dusíku a pro přidávání zkoumadel.

Lze použít manuální nebo automatické titrační zařízení. Při manuální titraci se použije byreta dělená po 0,005 ml a pH-metr s dostatečnou citlivostí se skleněnou a kalomelovou elektrodou.

Zkoušený roztok. 25,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,001 mol/l RS a zředí se jí na 250,0 ml.

Porovnávací roztok 25,0 mg chymotrypsinu BRP se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,001 mol/l RS a zředí se jí na 250,0 ml.

Roztoky se uchovávají při 0 °C až 5 °C. 1 ml každého roztoku se ohřeje na asi 25 °C a po 15 min se z každého roztoku použije 50 µl (odpovídá asi 25 nanokatalům) k utratí. Titrace se provádí v dusíkové atmosféře. Do reakční nádobky se přidá 10,0 ml roztoku chloridu vápenatého D, 01 mol/l RS a za míchání 0,35 ml acetyltyrosinethylesteru 0,2 mol/l RS. Když je teplota ustálena na (25,0 t 0,1) °C (asi po 5 min), upraví se pH přesně na hodnotu 8, 0 hydroxidem sodným 0,02 mol/l VS. Přidá se 50 µl zkoušeného roztoku (odpovídá asi 5 pg zkoušené látky) a měří se stopkami čas. Udržuje se pH na hodnotě 8,0 přidáváním hydroxidu sodného 0,02 mol/l VS a zaznamenává se objem přidaného roztoku po 30 s. Vypočítá se spotřeba hydroxidu sodného 0,02 molR VS za sekundu mezi 30 s a 210 s. Za stejných podmínek se provede titrace s porovnávacím roztokem a stanoví se spotřeba hydroxidu sodného 0,02 mol/ VS za sekundu.

Vypočítá se účinnost v mikrokatalech na mg podle vzorce:

v němž značí:

m - navážku zkoušeného látky v miligramech,
m' - navážku chymotrypsinu BRP v miligramech,
V - spotřebu hydroxidu sodného 0,02 mol/l VS za sekundu u zkoušeného roztoku,
V' - spotřebu hydroxidu sodného 0,02 mol/l VS za sekundu u porovnávacího roztoku,
A - účinnost chymotrypsinu BRP v mikrokatalech na miligram.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech při teplotě 2 °C až 8 °C, chráněn před světlem.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• množství chymotrypsinu a celková účinnost v mikrokatalech na balení,
• že amorfní látka je hygroskopická.

¹⁾ Pharmeuropa 1.2,1, 52 (2000). Závazné od 1. 1.