Natrii hyaluronas

2000

Natriumhyaluronat

Je to Sodná sůl kyseliny hyaluronové, glykosaminoglykan skládající se z kyseliny D-glukuronové a N-acetyl-n-glukosamindisacharidových jednotek. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 95,0 % až 105,0 % natriumhyaluronatu. Vnitřní viskozita je 90 % až 120 % hodnoty uvedené v označení.

Výroba

Natriumhyaluronat se extrahuje z kohoutích hřebínků nebo se získává fermentací ze Streptococci, Lancefeld Groups A a C. Vyrábí se metodami navrženými tak, aby se minimalizovali nebo odstranili původci infekce. Je-li vyráběn fermentací grampozitivních bakterií, musí být prokázáno, že výrobní postup snižuje nebo odstraňuje pyrogenní nebo zánětlivé složky buněčné stěny.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý velmi hygroskopický prášek nebo vláknif shluk. Je mírně rozpustný až dobře rozpustný ve vodě, prakticky nerozpustný v acetonu, v ethanolu a v etheru.

Zkoušky totožnosti

1. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24). zkoušené látky se shoduje s referenčním spektrem Ph. Eur. natriumhyaluronatu.
2. Vyhovuje zkoušce (a) na sodík (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. Zváží se množství zkoušené látky odpovídající 0,10 g vysušené látky a přidá se 30,0 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Opatrně se míchá za pomoci míchačky do úplného rozpuštění (asi 12 h).

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1).

Absorbance (1.2.25). Absorbance roztoku S měřená při 600 nm neraf větší než 0,01.

Hodnota pH (2.2.3). 5,0 až 8, 5; zkoušená látka se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R tak, aby vzniklý roztok obsahoval množství odpovídající 5 mg vysušené látky v mililitru.

Vnitřní viskozita. Natriumhyaluronat je velmi hygroskopický a musí být chráněn před vlhkostí během váženi.

Tlumivý roztok (chlorid sodný 0,1 S mol/l RS v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (D, 01 mol/l). Rozpustí se 0,78 g dihydrogenfosforečnanu sodného R a 4,50 g chloridu sodného R ve vodě R a zředí se jí na 500,0 ml (roztok A). Rozpustí se 1,79 g hydrogenfosforečnanu sodného R a 4,5 g chloridu sodného R ve vodě R a zředí se jí na 500,0 ml (roztok B). Smíchají se roztoky A a B tak, aby se dosáhlo hodnoty pH 7,0. Filtruje se přes filtr ze slinutého skla (4).

Zkoušený roztok (a) (koncentrace c, natriumhyaluronatu). Naváží se 0,200 g (mopl (pozn.: tato hodnota je pouze orientační a měla by být upravena po prvním měřeni viskozity zkoušeného roztoku (a)) zkoušené látky a zředí se 50,0 g (moh tlumivého roztoku při 4 °C. Roztok se protřepává 24 h při 4 °C. Naváží se 5,00 g (m1s) tohoto roztoku a zředí se 100,0 g (m1s) tlumivého roztoku při 25 °C. Roztok se 20 min promíchává třepáním. Zfiltruje se přes filtr ze slinutého skla (100) a prvních 10 ml se odstraní.

Zkoušený roztok (b) (koncentrace c4 natriumhyaluronatu). Naváží se 30,0 g (m3p) zkoušeného roztoku (a) a doplní se 10,0 g (m21 tlumivého roztoku při 25 °C. Roztok se 20 min promichává třepáním. Zfiltruje se přes filtr ze slinutého skla (100) a prvních 10 ml se odstraní.

Zkoušený roztok (c) (koncentrace c3 natriumhyaluronatu). Naváží se 20,0 g (m3; j zkoušeného roztoku (a) a zředí se 20,0 g (m3p) tlumivého roztoku při 25 °C. Roztok se 20 min pronúchává třepáním. Zfiltruje se přes filtr ze slinutého skla (100) a prvních 10 ml se odstraní.

Zkoušený roztok (d) (koncentrace ca natriumhyaluronatu). Naváží se 10,0 g (m4p) zkoušeného roztoku (a) a zředí se 30,0 g (mas% tlumivého roztoku při 25 °C. Roztok se 20 min promíchává třepáním. Zfiltruje se přes filtr ze slinutého skla (100) a prvních 10 ml se odstraní.

Měří se doba průtoku tlumivého roztoku (t0) a doba průtoku pro čtyři zkoušené roztoky (t1, , t2, t3 a t4) při (25,00 ± 0,03) °C (2.2.9). Použije se vhodný viskozimetr (specifikace: konstanta viskozimetru je asi 0,005 mmZ/sz, kinematická viskozita je v rozmezí 1 až 5 mm2/s, vnitřní průměr trubice R je 0, 53 mm, objem části C je 5,6 ml, vnitřní průměr trubice N v rozmezí 2,8 mm až 3,2 mm) s nálevkovitým dolním kapilárním koncem. Použije se stejný viskozimetr pro všechna měření; všechny doby průtoku se měri třikrát. Zkoušku lze hodnotit, jestliže se výsledky neliší více než o 0,35 % od průměru a jestliže doba průtoku ti není menší než 1,6 a není větší než 1,8násobku ta. Není-li tomu tak, upraví se hodnota mop a postup se opakuje.

Výpočet relativních viskozit. Pokud jsou hustoty roztoků natriumhyaluronatu a rozpouštědla téměř shodné, relativní viskozity η_ri (η_r1 η_r2 η_r3 a η_r4).a) se vypočítají z poměru dob průtoku odpovídajících roztoků t_i (t₁ , t₂, t₃ a t₄) k době průtoku t₀, ale bere se v úvahu faktor korekce kinetické energie kapiláry (B = 30 800 s³) podle následujícího vztahu:

Výpočet koncentrací

Výpočet koncentrace c₁ (vyjádřená v kg/m3) natriumhyaluronatu ve zkoušeném roztoku (a):

v němž značí:

x - obsah natriumhyaluronatu v procentech získaný při stanovení obsahu,
h - ztrátu sušením v %,
ρ₂₅ - 1005 kg/m3 (hustota zkoušeného roztoku při 25 °C).

Výpočet dalších koncentrací

Výpočet vnitřní viskozity

Vnitřní viskozita [rl] se vypočítá lineární regresní analýzou, metodou nejmenších čtverců použitím Martinovy rovnice:

log		ηr - 1		= log[η] + k[η]c .
		c

Dekadický antilogaritmus zadržení je vnitřní viskozita vyjádřená v m3/kg.

Síranové glykosaminoglykany. Je-li produkt extrahován z kohoutích hřebínků, vyhovuje následujícímu požadavku. Je třeba dodržovat vhodná bezpečnostní opatřeni pro práci s kyselinou chloristou při vyšší teplotě.

Zkoušený roztok. Množství zkoušené látky odpovídající 50,0 mg vysušené látky se převede do zkumavky délky 150 mm a vnitřního průměru 16 mm a rozpustí se v 1,0 ml kyseliny chloristé R.

Porovnávací roztok. 0,149 g síranu sodného R se rozpustí ve voděn a zředí se jí na 100,0 ml. 10,0 ml se zředí vodou R na 100,0 ml. 1,00 ml se odpaří ve zkumavce délky 150 mm a vnitřního průměru 16 mm v ohřívacím bloku při 90 °C až 95 °C a zbytek se rozpustí v 1,0 ml kyseliny chloristé R. Každá zkumavka se uzavře kouskem skleněné vaty. Zkumavky se umístí do ohřívacího bloku nebo do lázně se silikonovým olejem (180 °C) a zahřívá se do vzniku čirého bezbarvého roztoku (asi 12 h). Zkumavky se ryjmou a ochladí se při pokojové teplotě. Do každé zkumavky se přidají 3,0 ml roztoku chloridu barnatého R (33, 3 g/l), uzavřou se a intenzívně se protřepou. Zkumavky se nechají 30 min stát. Každá zkumavka se znovu protřepe a změří se Absorbance (2.2.25) při 660 nm za použití vody R jako kontrolní tekutiny. Absorbance zkoušeného roztoku není vyšší než absorbance porovnávacího roztoku (1 %).

Nukleové kyseliny. Absorbance (2.2.25) roztoku S při 260 nm je nejvýše 0,5.

Bílkoviny. Nejvýše 0,3 %.Pokud je látka určena k výrobě parenterálních lékových forem, jsou nejvýše 0,1 %. Zkoušený roztok (a). Zkoušená látka se rozpustí ve voděn tak, aby se získal roztok, obsahující množství odpovídající asi 10 mg vysušené látky v mililitru.

Zkoušený roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (a) a vody R.

Porovnávací roztoky. Připraví se ze zásobního roztoku albuminu hovězího R (0,5 mg/ml) ve vodě R. Připraví se 5 ředění zásobního roztoku obsahující 5 μg/ml až 50 pg/ml albuminu hovězího R.

Přidá se 2,0 ml čerstvě připraveného vinanu měďnatého RS3 do zkumavek obsahujících 2,5 ml vody R (kontrolní roztok), 2,5 ml zkoušených roztoků (a) nebo (b) nebo 2,5 ml porovnávacích roztoků. Po každém přidání se zamíchá. Po asi 10 min se do každé zkumavky přidá 0,50 ml směsi stejných objemových dílů vody R a zkoumadla fosfomolybdenan-wolframového R. Po každém přídavku se zamíchá. Po 30 min se změří Absorbance (2.2.25) každého roztoku při 750 nm proti kontrolnímu roztoku. Obsah bílkovin ve zkoušeném roztoku se určí z kalibrační lmvky získané z pěti porovnávacích roztoků.

Chloridy (2.4.4). Rozpustí se 67 mg ve 100 ml vody R. 15 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (0,5 %).

Železo. Nejvýše 80 µg/g; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda II).

Zkoušený roztok. Množství zkoušené látky odpovídající 0,25 g vysušené látky se rozpustí v 1 ml kyseliny dusičné R zahříváním na vodní lázni. Ochladí se a zředí se vodou R na 10,0 ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se dva porovnávací roztoky stejným způsobem jako zkoušený roztok. K rozpuštěné zkoušené látce se přidá 1,0 ml, resp. 2,0 ml základního roztoku železa (10 μg Fe/ml).

Změří se absorbance při 248,3 nm za použití železné lampy s dutou katodou jako zdroje záření, transmisního svazku 0,2 nm a plamene vzduch-acetylen.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 20,0 %; 0,500 g se suší 6 h při 100 °C až 110 °C nad oxidem fosforečným R.

Mikrobiální znečištění. Celkový počet živých aerobních mikroorganismů (2.ó.12) je nejvýše 102 v gramu; stanoví se s 1 g zkoušené látky.

Sterilita (2. ó.l). Pokud je látka určena k výrobě sterilních lékových forem bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.ó.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 0,5 m.j. endotoxiny v miligramu. Pokud je látka určena k výrobě očních přípravků nebo intraartikulárních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriáhú endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 0,05 m.j. endotoxiny v miligramu.

Stanovení obsahu

Obsah kyseliny glukuronové se stanoví reakcí s karbazolem, způsobem popsaným dále.

Zkoumadlo A. 0,95 g tetraboritanu sodného R se rozpustí ve 100,0 ml kyseliny sírové R.

Zkoumadlo B. 0,125 g karbazolu R se rozpustí ve 100,0 ml ethanolu R.

Zkoušený roztok. Připraví se ve trojím provedení. 0,170 g se rozpustí ve voděn a zředí se jí na 100,0 g. 10,0 g tohoto roztoku se zředí vodou R na 200,0 g.

Porovnávací zásobní roztok. Rozpustí se 0,100 g kyseliny n-glukuronové R předem vysušené do konstantní hmotnosti ve vakuu nad oxidem fosforečným R (2.2.32) ve vodě R a zředí se jí na 100,0 g.

Porovnávací roztoky. Připraví se pět ředění porovnávacího zásobního roztoku, která obsahují od 6,5 µg/g do 65 µg/g kyseliny o-glukuronové R. 25 zkumavek, označených 1 až 25, se umístí do ledové lázně. Přidá se 1,0 ml z pěti porovnávacích roztoků ve trojím provedení do zkumavek 1 až 15 (zkumavky s porovnávacími roztoky), 1,0 ml ze tří zkoušených roztoků ve trojím provedení do zkumavek 16 až 24 (zkumavky se zkoušenými roztoky) a 1,0 ml vody R do zkumavky 25 (kontrolní roztok). Do každé zkumavky se přidá 5,0 ml čerstvě připraveného zkoumadla A. Zkumavky se těsně uzavřou plastovými uzávěry, obsah se protřepe a umístí se přesně na 15 min na vodní lázeň. Ochladí se v ledové lázni a do každé zkumavky se přidá 0,20 ml zkoumadla B. Zkumavky se opět uzavřou, proptřepou se a opět se umístí přesně na 15 min na vodní lázeň. Ochladí se na pokojovou teplotu a měří se Absorbance (2.2.25) roztoků při 530 nm proti kontrolnímu roztoku.

Průměrná koncentrace kyseliny D-glukuronové ve zkoušených roztocích se stanoví z průměrných absorbancí odečtených z kalibrační křivky získané pro každý porovnávací roztok.

Vypočítá se obsah natriumhyaluronatu v procentech podle vztahu:

v němž značí:

c_g - pnůněr koncentrací kyseliny D-glukuronové ve zkoušených roztocích v miligramech na gram,
c_s - průměr koncentrací zkoušené látky ve zkoušených roztocích v miligramech na gram,
Z - stanovený obsah C₆H, o0~ v kyselině D-glukuronové R v procentech,
h - ztrátu sušením v procentech,
401,3 - relativní molekulovou hmotnost disacharidového fragmentu,
194,1 - relativní molekulovou hmotnost kyseliny glukuronové.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem a vlhkostí. Jestliže je látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• vnitřní viskozita,
• původ látky,
• zamýšlené použití látky,
• kde je to vhodné, zda je látka sterilní,
• kde je to vhodné, zda je látka vhodná pro jiné parenterálni použití než intraartikulární,
• kde je to vhodné, zda je látka vhodná pro parenterální použití, včetně intraartikulárního,  
• kde je to vhodné, zda je látka vhodná pro nitrooční podání.