Pancreatis pulvis

corr

Pankreatin prášek

Synonymum. Pancreatinum

Připravuje se z čerstvé nebo zmrazené slinivky břišní (pankreatu) savců. Látka obsahuje enzymy s proteolytickou, lipolytickou a amylolytickou účinností.

1 miligram látky obsahuje nejméně 1,0 Ph.Eur.j. celkové proteolytické účinnosti, 15 Ph.Eur.j. lipolytické účinnosti a 12 Ph.Eur.j. amylolytické účinnosti. Připravuje se za podmínek, které minimalizují stupeň mikrobiálního znečištění.

Vlastnosti

Slabě hnědý amorfní prášek. Je částečně rozpustný ve vodě, prakticky nerozpustný v lihu 96% a v etheru.

Zkoušky totožnosti

1. 0,5 g se rozetře s 10 ml vody R a nastaví se na hoďnotu pH 8,0 přidáním hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS za použití červeně kresolové RS jako indikátoru. Suspenze se rozdělí na dvě stejné části (suspenze (a) a suspenze (b)). Suspenze (a) se povaří. Ke každé suspenzi se přidá několik částeček červeně Kongo--fibrinu Fc, zahřeje se na 38 °C až 40 °C a při této teplotě se udržuje 1 h. Suspenze (a) je bezbarvá nebo slabě růžová a suspenze (b) je zbarvena zřetelně více červeně.
2. 0,25 g se rozetře s 10 ml vody R a nastaví se na hodnotu pH 8,0 přidáním hydroxidu sodného 0,1 mol/l Fc~S za použití 0,1 ml červeně kresolové RS jako indikátoru. Suspenze se rozděli na 2 stejné části (suspenze (a) a suspenze (b)). Suspenze (a) se povaří. 0,1 g škrobu rozpustného R se rozpustí ve 100 ml vroucí vody R, vaří se 2 min a po ochlazení se zředí vodou R na 150 ml. K 75 ml roztoku škrobu se přidá suspenze (a) a ke zbývajícím 75 ml se přidá suspenze (b). Každá směs se zahřeje na 38 °C až 40 °C a při této teplotě se udržuje 5 min.

   K 1 ml každé směsi se přidá 10 ml jodu RS2. Směs s obsahem suspenze (a) je zbarvena intenzívně modrofialově; směs získaná se suspenzi (b) má zbarvení roztoku jodu.

Zkoušky na čistotu

Obsah tuku. V zařízení na extrakci se 1,0 g extrahuje 3 h etherem petrolejovým Rl. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se suší 2 h při 100 °C až 105 °C. Zbytek váží nejvýše 50 mg (5,0 %).

Ztráta sušením (2.2.32).. Nejvýše 5,0 %; 0,500 g se suší 4 h ve vakuové sušárně při 60 °C při tlaku nepřevyšujícím 670 Pa.

Mikrobiální znečištění (2.6.12). Nejvýše 104 živých mikroorganismů v~amu. Stanoví se plotnovou metodou. Vyhovuje zkoušce na nepřítomnost Escherichia coli a Salmonella (2. 6.13).

Stanovení obsahu

Celková proteolytická účinnost. Stanoví se porovnáním množství peptidů, které se nevysrážej í roztokem kyseliny trichloroctové R (50 g/l), uvolněných za min z roztoku kaseinového substrátu s množstvím peptidů uvolněných pankreatinem práškem (proteasou) BRP ze stejného substrátu a za stejných podmínek.

Roztok kaseinu. V 5 ml vody R se suspenduje množství kaseinu BRP odpovídající 1,25 g vysušené látky, přidá se 10 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS a míchá se 1 min. (Obsah vody v kaseinu BRP se stanoví před provedením Zkoušky zahříváním 4 h ve vakuu při 60 °C). Přidá se 60 ml vody R a míchá se elektromagnetickým míchadlem, až je roztokprakticky čirý. Pak se upraví pH na hodnotu 8,0 hydroxidem sodným 0,1 mol/l RS nebo kyselinou chlorovodíkovou 0,1 mol/l PcS a zředí se vodou R na 100,0 ml. Roztok se použije v den přípravy.

Roztok enterokinary. 50 mg enterokinary BRP se rozpustí v chloridu vápenatém 0,02 mol/l Fc~S a zředí se jím na 50,0 ml. Roztok se použije v den přípravy.

Zkoušená suspenze a porovnávací suspenze se připraví a jejich zředění se provede při 0 °C až 4 °C.

Zkoušená suspenze. 0,100 g zkoušené látky se roztírá 5 min s 25 ml chloridu vápenatého 0,02 mol/l RS, který se přidává postupně. Převede se kvantitativně do odměrné baňky a zředí se chloridem vápenatým 0,02 mol/l RS na 100,0 ml. K 10,0 ml této suspenze se přidá 10,0 ml roztoku enterol~inasy a zahřívá se 15 min ve vodní lázni při (35 f 0,5) °C. Pak se ochladí a zředí tlumivým roztokem boritanovým o pH 7,5 při (5 f 3) °C na koncentraci asi 0,065 Ph.Eur.j. celkové proteolytické účinnost v mililitru, počítáno na základě předem stanovené účinnosti.

Porovnávací suspenze. Připraví se suspenze pankreatinu prášku (proteasy) BRP, jak bylo popsáno u zkoušené suspenze, ale bez přidání enterokinary, aby byla získána známá konečná koncentrace asi 0,065 Ph.Eur.j. na ml, počítáno na základě předem stanovené účinosti.

Zkumavky se označí dvojmo T, Tb, S, , S, b, SZ, SZb, S3, S3b; jedna zkumavka se označí B.

Do zkumavek se přidá tlumivý roztok boritanový o pH 7, S takto:

• B: 3,0 ml,
• S, a S, b: 2,0 ml,
• SZa SZb, T a Tb: 1,0 ml.

Do zkumavek se dále přidá porovnávací suspenze takto:

• S, aS, b:l, Oml,
• SZ a SZb: 2,0 ml, 
• S3 a S3b: 3,0 ml.

Přidají se 2,0 ml zkoušené suspenze do zkumavek T a Tb.

Přidá se 5 ml roztoku kyseliny trichloroctové R (50 g/l) do zkumavek B, S, b, SZb, S3b a Tb a promíchá se zatřepáním.

Zkumavky a roztok kaseinu se umístí do vodní lázně při (35 ~ 0,5) °C a do každé zkumavky se vloží skleněná tyčinka. Když je dosaženo tepelné rovnováhy, přidají se 2 ml roztoku kaseinu do zkumavek B, S, b, SZb, S3b a Tb a promíchá se. V čase 0 se přidají postupně v intervalech 30 s 2,0 ml roztoku kaseinu do zkumavek S, , SZ, S3a T. Po každém přidání se ihned promíchá. Přesně 30 min po přidání kaseinového roztoku (dodržují se pravidelné intervaly) se přidá 5,0 ml roztoku kyseliny trichloroctové R (50 g/l) do Zkumavek S„ SZ, S3a T a promíchá se. Zkumavky se vyjmou z vodní lázně a ponechají se stát 20 min při teplotě místnosti.

Obsah každé Zkumavky se dvakrát zfiltruje stejným vhodným filtračním papírem, který byl předtím promyt roztokem kyseliny trichloroctové R (50 g/l) a potom vodou R a vysušen.

Vhodný filtrační papír vyhovuje následující zkoušce: zfiltruje se 5 ml roztoku kyseliny trichloroctové R (50 g/l) kruhovým bílým filtračním papírem průměru 7 cm; Absorbance (2.2.25) tohoto filtrátu měřená při 275 nm za použití nefiltrovaného roztoku kyseliny trichloroctové R (50 g/l) jako kontrolní tekutiny nepřevyšuje hodnotu 0,04.

Schéma výše uvedených operací je uvedeno v tabulce.

Změří se Absorbance (2.2.25) filtrátů při 275 nm, přičemž se použije filtrát získaný ze zkumavky B jako kontrolní tekutina.

Průměrné hodnoty absorbance filtrátů získané ze zkumavek S1, S2 a S3 se korigují odečtením průměrných hodnot získaných jednotlivě pro filtráty ze zkumavek S1b S2b S3b. Sestrojí se kalibrační křivka vynesením korigovaných hodnot absorbance proti objemu použité porovnávací suspenze.

Stanoví se účinnost zkoušené látky za použití korigované absorbance pro zkoušenou suspenzi (T - Tb) a kalibrační křivky, přičemž je třeba vzít v úvahu zřeďovací faktory.

Zkoušku lze hodnotit, pokud jsou korigované hodnoty absorbance v rozmezí 0,15 až 0,60.

Lipolytická účinnost. Stanoví se porovnáváním rychlosti, při níž suspenze pankreatinu prášku hydrolyzuje substrát - emulzi olivového oleje, s rychlostí, při níž suspenze pankreatinu prášku (amylasa a lipasa) BRP hydrolyzuje stejný substrát za stejných podmínek. Zkouška se provede v dusíkové atmosféře.

Zásobní emulze olivového oleje. Do kádinky na 800 ml o průměru 9 cm se převede 40 ml oleje olivového R, 330 ml arabské klovatiny RS a 30 ml vody R. Na dno kádinky se umístí elektrický mixér a kádinka se vloží do nádoby obsahující líh 96% R a dostatečné množství ledu jako chladicí směsi. Emulguje se za použití mixéru průměrnou rychlostí 1000 ot./min až 2000 ot./min. Ochladí se na 5 °C až 10 °C a rychlost mixování se zvýší na 8000 ot./min. Mixuje se 30 min, přičemž se teplota udržuje pod 25 °C neustálým přidáváním rozmělněného ledu do chladicí směsi. (Vhodná je též směs chloridu vápenatého a rozmělněného ledu.) Zásobní emulze se uchovává v chladničce a použije se do 14 dnů. Emulze se nesmí rozpadnout do dvou vrstev. Průměr částeček emulze se kontroluj e pod mikroskopem. Alespoň 90 % má průměr pod 3 µm a žádná nemá průměr větší než 10 µm. Emulze se důkladně protřepe před přípravou emulzního substrátu.

Emulze olivového oleje. Pro 10 stanovení se smíchají následující roztoky v uvedeném pořadí: 100 ml zásobní emulze, 80 ml trometamolu RS, 20 ml čerstvě připraveného roztoku sodné soli taurocholanu BPcP (80 g/l) a 95 ml vody R. Použije se v den přípravy.

Zařízení. Použije se reakční nádoba objemu asi 50 ml opatřená:

• přístrojem, který udrží teplotu na (37 f 0,5) °C,
• elektromagnetickou míchačkou,
• víčkem s otvory pro vložení elektrod, pro přítok byretou, pro trubičky pro přívod dusíku a pro přidávání zkoumadel.

Může být použito titrační zárízení manuální nebo automatické. V případě zárízení manuálního je byreta dělena po 0,005 ml a pH-metr je vybaven stupnicí s velkým měřicím rozsahem a skleněnou a kalomelovou elektrodou. Po každém stanovení se reakční nádoba vyprázdní odsátím a promyje se několikrát vodou R, přičemž se zbytky tekutiny po výplachu odstraňují odsátím.

Zkoušená suspenze. V malé třence ochlazené na 0 °C až 4 °C se pečlivě roztírá množství zkoušené látky ekvivalentní asi 2500 Ph.Eur.j. lipolytické účinnosti s 1 ml vychlazeného tlumivého roztoku maleinanového o pH 7,0 (rozpouštědlo lipasy), až se získá velmi j emná suspenze. Ta se pak naředí chlaďným tlumivým roztokem maleinanovým o pH 7,0, převede se kvantitativně do odměrné baňky na 100,0 ml a zředí se po značku chladným tlumivým roztokem. Během titrace se baňka se zkoušenou suspenzí uchovává ve vodě s ledem.

Porovnávací suspenze. Aby se vyloučila absorpce vody vytvořené kondenzací, otevře se nádoba, až když porovnávací přípravek dosáhne teploty místnosti. Suspenze pankreatinu prášku (amylasa a lipasa) BFcP se připraví, jak je popsáno u zkoušené suspenze, přičemž se použije množství odpovídající asi 2500 Ph.Eur.j.

Titrace se provede ihned po přípravě zkoušené suspenze a porovnávací suspenze. Do reakční nádobky vytemperované na (37 + 0,5) °C se převede 29,5 ml emulze olivového oleje, nádobka se opatří míchadlem, elektrodami a byretou (její špička je ponořena do emulze olivového oleje).

Nádobka se uzavře víkem a zapne se přístroj. Opatrně se přidává za stálého míchání hydroxid sodný 0,1 mol/l VS, až je dosaženo pH 9,2. Za použití rychle tekoucí dělené pipety se přidá asi 0,5 ml předem zhomogenizované porovnávací suspenze, spustí se stopky a kontinuálně se přidává hydroxid rodný 0,1 mol/l VS, aby se udrželo pH na hoďnotě 9,0. Přesně po 1 min se odečte spotřeba roztoku hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS. Toto měření se provede ještě čtyřikrát. První hodnota se nepoužije a z dalších čtyř odečtení se vypočte průměr (S, ). Provedou se další dvě stanovení (~ a S3). Vypočte se průměr hoďnot S 1, SZ a S3. Průměrná spotřeba hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS by měla být asi 0,12 ml/min s limity 0,08 ml/min až 0,16 ml/min.

Stejným způsobem se provedou tři stanovení se zkoušenou suspenzí (T1 T2 a T3). Je-li spotřeba hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS mimo limity 0,08 ml/min až 0,16 ml/min, stanovení se opakuj e s množstvím zkoušené suspenze, které je vhodnější, avšak v rozmezí mezi 0,4 ml a 0,6 ml. Jinak se přizpůsobí množství zkoušené látky tak, aby vyhovovalo poďmínkám zkoušky. Vypočítá s e průměr hoďnot T1, T2 a T3.

Účinnost v Ph.Eur.j. na mg se vypočítá ze vztahu:

v němž značí:

n - průměrnou spotřebu hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS za min při titraci zkoušené suspenze,
n₁ - průměrnou spotřebu hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS za min při titraci porovnávací suspenze,
m - hmotnost zkoušené látky v miligramech,
m₁ - hmotnost porovnávacího přípravku v miligramech,
A - účinnost pankreatinu prášku (amylasa a lipasa) BRP v Ph.Eur.j. v miligramu.

Amylolytická účinnost. Stanoví se porovnáním rychlosti, při níž suspenze pankreatinu prášku hydrolyzuje substrát - roztok škrobu, s rychlostí, při níž suspenze pankreatinu prášku (amylasa a lipasa) BRP hydrolyzuje stejný substrát za stejných podmínek.

Roztok škrobu. K množství škrobu BRP odpovídajícímu 2,0 g vysušené látky se přidá 10 ml vody R a promíchá se. (Obsah vody ve škrobu BRP se stanoví před Zkouškou sušením 4 h při 120 °C.) Tato suspenze se za stálého míchání přidává ke 160 ml vroucí vody R. Nádoba se promyje několikrát postupně vždy 10 ml vody R a promývací tekutina se přidá k horkému roztoku škrobu. Zahřej e se za stálého míchání k varu. Ochladí se na teplotu místnosti a zředí se vodou R na 200 ml. Roztok se použije v den přípravy.

Zkoušená suspenze. Množství zkoušené látky odpovídající asi 1500 Ph.Eurj. Amyyolytické účinnosti se roztírá 15 min s 60 ml tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 6,8 (1). Převede se kvantitativně do odměrné baňky a zředí se tlumivým roztokem fosforečnanovm o pH 6,8 (1) na 100,0 ml. Porovnávací suspenze. Připraví se suspenze pankreatinu prášku (amylasa a lipasa) BRP, jak je popsáno pro zkoušenou suspenzi, za použití množství odpovídajícího asi 1500 Ph.Eur.j.

Do zkumavky dlouhé 200 mm o průměru 22 mm se zabroušenou zátkou se převede 25,0 ml roztoku škrobu, 10,0 ml tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 6,8 (1) a 1,0 ml roztoku chloridu sodného R (11,7 g/l). Zkumavka se uzavře, protřepe a umístí se do vodní lázně při (25,0 f 0,1) °C. Když nastane vyrovnání teploty, přidá se 1,0 ml zkoušené suspenze a spustí se stopky. Promíchá se a zkumavka se dá do vodní lázně. Přesně po 10 min se přidají 2 ml kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS. Směs se převede kvantitativně do kuželové baňky na 300 ml se zabroušenou zátkou. Za stálého míchání se přidá 10,0 ml jodu 0,05 mol/l VS a ihned 45 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS. Nechá se stát v temnu 15 min při teplotě 15 °C až 25 °C. Přidají se 4 ml směsi objemových dílů kyseliny sírové R a vody R (1 + 4). Nadbytek jodu se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za použití mikrobyrety. Provede se slepá zkouška za přidání 2 ml kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS před podáním zkoušené suspenze. Stejným způsobem se provede titrace porovnávací suspenze. Amylolytická aktivita v Ph.Eur.j. na miligram se vypočte ze vztahu:

v němž značí:

n - spotřebu thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS při titraci zkoušené suspenze v mililitrech,
n₁ - spotřebu thiosíranu sodného 0,1 mol/l T~Spři titraci porovnávací suspenze v mililitrech,
n' - spotřebu thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS při slepé zkoušce zkoušené suspenze v mililitrech,
n'₁ - spotřebu thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS při slepé zkoušce porovnávací suspenze v mililitrech,
m - hmotnost zkoušené látky v miligramech,
m₁ - hmotnost porovnávacího přípravku v miligramech,
A - účinnost pankreatinu prášku (amylasa a lipasa) BRP v Ph.Eur.j. v miligramu.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, při teplotě nepřevyšující 15 °C.