Vaccinum staphylococcicum

N

Vakcína proti stafylokokům

Synonymum. Očkovací látka proti stafylokokům

Je to sterilní roztok detoxikovaných nativních stafylokokových toxinů a exofermentů. Připravuje se formaldehydovou detoxikací toxinů vytvořených při růstu kultury mikroba Staphylococcus aureus.

Výroba

Várka toxoidů

Výchozí kultury, které vytvářejí stafylokokové toxiny pro výrobu toxoidů, se připravují definovaným systémem jednotné inokulace, který zachovává jejich toxinogenitu a v případě potřeby ji obnovuj e cíleným výběrem. Jeden nebo více kmenů Staphylococcus aureus známého původu a udržování se kultivuje na celofánu na vhodné pevné půdě. Zvlášť se kultivuje kmen produkující převážně α-toxin a zvlášť kmen produkující β a δ-toxin. Na konci kultivace se zkouší čistota každé kultury a kontaminované kultury se vyřadí. Toxiny se oddělí od bakteriální masy. Kontroluje se DHM toxinů α,  β a δ. DHM (dosis haemolytica minima) je nejmenší množství toxinu, které ještě hemolyzuje 1% suspenzi příslušných zvířecích erytrocytů. Toxiny se detoxikují formaldehydem a teplem. Jednotlivé sklizně se mohou pro přípravu várky toxoidu spojit.

K přípravě konečné várky vakcíny se použijí pouze várky α-toxoidu a várky β-toxoidů a δ-toxoidů, které vyhovují následujícím požadavkům.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Nepřítomnost α-toxinu. Do zkumavek se naředí po 0,5 ml zkoušený toxoid geometrickou řadou, počínaje koncentrovaným toxoidem až do ředění 1 : 4, pomocí roztoku chloridu sodného R (9 g/l) a želatiny R (1 g/l), jehož pH bylo upraveno na 7,2. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml 1% (V/V) suspenze králičích erytrocytů, čerstvě odebraných do vhodného protisrážlivého roztoku a 3x promytých roztokem chloridu sodného R (9 g/l). Po inkubaci 1 h při 37 °C a další 1 h při pokojové teplotě se odečítá hemolýza. Toxoid vyhovuje zkoušce, když v žádné zkumavce nedojde k hemolýze.

Nepřítomnost (β-toxinu. Do zkumavek se naředí po 0,5 ml zkoušený toxoid geometrickou řadou, počínaje koncentrovaným toxoidem až do ředění 1 : 4, pomocí roztoku chloridu sodného R (9 g/l) a želatiny R (1 g/l), jehož pH bylo upraveno na 7,2. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml 1% (V/V) suspenze beraních erytrocytů, čerstvě odebraných do vhodného protisrážlivého roztoku a 3x promytých roztokem chloridu sodného R (9 g/l). Po inkubaci 1 h při 37 °C a dalších 20 h při (5 f 3) °C se odečítá hemolýza. Toxoid vyhovuje zkoušce, když v žádné zkumavce nedojde k hemolýze.

Nepřítomnost δ-toxinu. Do zkumavek se naředí po 0,5 ml zkoušený toxoid geometrickou řadou, počínaje koncentrovaným toxoidem až do ředění 1 : 4, pomocí roztoku chloridu sodného R (9 g/l) a želatiny R (1 g/l), jehož pH bylo upraveno na 7,2. Po přidání 1 mezinárodní jednotky referenčního a-stafylokokového antitoxinu v objemu 0,10 ml se směs ponechá vázat 15 min při pokojové teplotě. Pak se přidá do každé zkumavky 0,5 ml 1% (V/V) suspenze morčecích erytrocytů, čerstvě odebraných do vhodného protisrážlivého roztoku a 3x promytých roztokem chloridu sodného R (9 g/l). Po inkubaci 1 h při 37 °C a další 1 h při pokojové teplotě se odečítá hemolýza. Toxoid vyhovuje zkoušce, když v žádné zkumavce nedojde k hemolýze.

Nepřítomnost leukocidinu. Stanoví se leukocidní aktivita zkoušeného dialyzovaného toxoidu. Do zkumavek se naředí po 1 ml zkoušený toxoid geometrickou řadou, počínaje koncentrovaným toxoidem až do ředění 1 : 4, pomocí tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným o pH 7,4. Pak se přidá 0,1 ml leukocytárního náplavu získaného následujícím způsobem: 20 ml čerstvé lidské krve se odebere do roztoku připraveného smícháním 2 ml 10% roztoku dextranu 70 na injekci (100 g/l) a glukosy R (50 g/l) a 2 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l) a edetanu disodného R (10 g/l). Odebraná krev se nechá sedimentovat v odměrném válci 60 min až 90 min při 37 °C, supernatant se odsaje, odstředí a znovu se odsaje asi 90 % supernatantu. Sedimentované leukocyty se roztřepou ve zbylém supernatantu a doplní se tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,4 do celkového objemu 10 ml. Zkoušený toxoid s leukocyty se inkubuje 1 h při 37 °C. Po přidání 0,1 ml roztoku červeně Kongo R (10 g/l) se prohlíží nativní preparáty zhotovené z obsahu jednotlivých zkumavek a počítají se modrozeleně zbarvené živé buňky a hnědě zbarvené mrtvé buňky. Hodnotí se minimálně 25 živých buněk vedle současně nalezených mrtvých buněk. Toxoid vyhovuje zkoušce, pokud je leukocidní aktivita nulová, tj. převažují živé buňky zbarvené modrozeleně nad mrtvými hnědými buňkami.

Obsah vazných jednotek Nejméně 30 LB/ml. Provádí se u várky α-toxoidu.

Vazná jednotka toxoidu (limes binding, LB) je ono množství toxoidu, které ve směsi s 1 m.j. referenčního a-stafylokokového antitoxinu ho vyváže tak, že přidaná 1 /4 LH+ dávky toxinu způsobí úplnou hemolýzu 5% (V/V) suspenze králičích erytrocytů.

LH+ dávka toxinu (limes haemolysis, LH) je ono množství toxinu, které po smíšení a inkubaci s 1 m.j. referenčního a-stafylokokového antitoxinu ještě hemolyzuje králičí erytrocyty. Mezinárodní jednotka je takové množství α-stafylokokového antitoxinu, které po smíšení a inkubaci s 1 LH+ dávkou toxinu ještě připustí hemolýzu králičích erytrocytů.

Příprava roztoku toxinu. Stafylokokový toxin o známé účinnosti se předtitruje s referenčním antistafylokokovým sérem a podle výsledků této titrace se toxin naředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) a želatiny R (1 g/l), jehož pH bylo upraveno na 7,2 tak, aby 1/4 LH+ dávky toxinu byla obsažena v 0,1 ml. Tato dávka se použije pro vlastní titraci toxoidu.

Stanovení obsahu vazných jednotek. Zkoušený toxoid (vakcína) se podle předpokládaného účinku naředí do zkumavek aritmetickou řadou, ve které bude stoupající množství toxoidu 0 0,01 ml doplněné na celkový objem 1 ml roztokem chloridu sodného R (9 g/l) a želatiny R (1 g/l), jehož pH bylo upraveno na 7,2. Po přidání 1 m.j. referenčního a-stafylokokového antitoxinu v objemu 0,10 ml se směs ponechá vázat 15 min až 20 min při teplotě 18 °C až 20 °C. Po přidání 1/4 LH+ dávky toxinu v objemu 0,10 ml se ponechá vázat dalších 15 min při stejné teplotě. Pak se ke směsi přidá 5% (V/V) suspenze králičích erytrocytů v objemu 0,10 ml a po inkubaci 1 h při 37 °C a další 1 h při teplotě 18 °C až 20 °C se odečítá stupeň hemolýzy. Zjistí se zkumavka, ve které došlo ještě k hemolýze, a určí se obsah vazných jednotek.

Konečná várka vakcíny

Obsahuje nativní stafylokokový a-toxoid v množství 7,6 až 10,7 LB/ml. Dále obsahuje nativní stafylokokové β-toxoidy a δ-toxoidy v množstvích limitovaných požadavky na obsah DHM nativních toxinů.

K přípravě šarže se použije pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Protimikrobní konzervační látky. 85 % až 115 % zamýšleného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Účinnost. Provedou se zkoušky popsané v odstavci Stanovení účinnosti.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů. Obaly se uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

K použití se může uvolnit šarže, která odpovídá všem požadavkům dále uvedeným v odstavcích Zkoušky totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti. Pokud byla zkouška na neškodnost, stanovení obsahu volného formaldehydu a stanovení protimikrobní konzervační látky a stanovení účinnosti provedeny s vyhovujícími výsledky u konečné várky vakcíny, mohou se u šarže vypustit.

Zkoušky totožnosti

1. Zkouška imunogenity je zároveň zkouškou totožnosti.

2. 0,2 ml zkoušené vakcíny se smíchá s 0,2 ml referenčního stafylokokového antitoxinu o koncentraci 10 m.j./ml a nechá se vázat 15 min při 18 °C až 20 °C. Po přidání 0,2 ml dávky toxinu o koncentraci 1/4 LH+ v objemu 0,10 ml určené dle předchozí titrace se směs ponechá vázat dalších 15 min při stejné teplotě. Pak se přidá ke směsi 5% (V/V) suspenze králičích erytrocytů v objemu 0,10 ml a nechá se inkubovat 1 h při 37 °C. Zkouška vyhovuje, pokud ve směsi došlo k hemolýze.

Zkoušky na čistotu

Zkouška na reaktivitu a toxicitu

1. Dvěma zdravým králíkům (nejlépe bílým novozélandským) o hmotnosti 2 kg až 3 kg, kterým předtím nebyla podána žádná látka, jež by mohla narušit zkoušku, se vstříkne intradermálně 0,2 ml vakcíny. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže během 48 h následujících po injekci nevyvolá vznik lokální reakce v místě vpichu. V případě reakce se zkouška opakuje na dvojnásobném počtu zvířat. Jestliže při opakované zkoušce dojde ke vzniku reakce, vakcína nevyhovuje.
2. Dvěma zdravým králíkům (činčilám) o hmotnosti 2 kg až 3 kg, kterým předtím nebyla podána žádná látka, jež by mohla narušit zkoušku, se vstříknou intravenózně 3 ml vakcíny na 1 kg hmotnosti králíka. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže se u zvířat během 7 dnů následujících po injekci neprojeví toxické příznaky, úbytek hmotnosti a žádné zvíře neuhyne. V případě reakce se zkouška opakuje na dvojnásobném počtu zvířat. Jestliže při opakované zkoušce dojde ke vzniku reakce, vakcína nevyhovuje.

Volný formaldehyd (2.4.18). Přípravek vyhovuje požadavku uvedenému v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Nejméně nejnižší prokazatelně účinné množství, nejvýše 115 % deklarovaného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti.

Stanovení obsahu vazných jednotek

Hotový výrobek obsahuje 7,6 až 10,7 LB/ml α-stafylokokového toxoidu. Stanoví se postupem uvedeným v odstavci Obsah vazných jednotek.

Stanovení imunogenity

1. Nejméně devíti zdravým morčatům o hmotnosti asi 280 g, kterým předtím nebyla podána žádná látka, jež by mohla narušit zkoušku, se každému vstříknou podkožně dvě dávky zkoušené vakcíny po 1 ml tak, že se druhá dávka aplikuje za 1 týden po dávce první. Za 14 dnů po podání druhé dávky jsou morčata vykrvácena a v sérech jednotlivých zvířat se stanoví obsah protilátek proti stafylokokovému α-toxinu.
2. Nejméně třem králíkům o hmotnosti 2,3 kg až 2,7 kg, kterým předtím nebyla podána žádná látka, jež by mohla narušit zkoušku, a jejichž přirozený titr byl nižší než 0,1 m.j./ml, se každému vstříkne intravenózně v tý denních intervalech 1 ml, 2 ml a 3 ml zkoušené vakcíny. Za týden po třetí dávce jsou králíci vykrváceni a v sérech jednotlivých zvířat se stanoví obsah protilátek proti stafylokokovému α-toxinu.

Podle výsledků předtitrace se toxin naředí tak, aby obsahoval 1 LH+ dávku v objemu 0,2 ml. Do řady zkumavek se vhodně naředí séra imunizovaných zvířat. Po přidaní 1 LH+ dávky toxinu v 0,2 ml se směs nechá vázat 20 min při pokojové teplotě. Po této době se přidá ke směsi 5% (V/V) suspenze králičích erytrocytů v objemu 0,1 ml a po inkubaci 1 h při 37 °C a 1 h při pokojové teplotě se odečítá hemolýza - tj. poslední zkumavka, ve které ještě došlo k hemolýze erytrocytů. Hodnocení: Séra jedné třetiny imunizovaných morčat obsahují nejméně 1 m.j. a séra dvou třetin morčat alespoň 0,5 m.j. α-stafylokokového antitoxinu v 1 ml.

Séra imunizovaných králíků obsahují v průměru nejméně 3 m.j. α-stafylokokového antitoxinu vlml.

Nevyhovuje-li vakcína ve stanovení imunogenity, opakuje se tato zkouška na dvojnásobném počtu zvířat.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.