Glucagonum
Glukagon
| C153H225N43O49S | Mr 3482,78 | CAS 16941-32-5 |
Je to polypeptidický hormon získaný z hovězí nebo prasečí slinivky. Podporuje štěpení glykogenu v játrech a tím zvyšuje koncentraci glukosy v krvi. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje v miligramu nejméně 1 m.j.
Glukagon se připravuje za podmínek, které zajišťují minimální mikrobiální kontaminaci.
Vlastnosti
Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě a ve většině organických rozpouštědel. Je rozpustný ve zředěných minerálních kyselinách a ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů.
Zkoušky totožnosti
Zkoušky na čistotu
Absorbance. 2,5 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 10,0 ml. Specifická Absorbance (2.2.25) měřená v maximu při 276 nm je 21 až 25, počítáno na vysušenou látku.
Příbuzné látky. Stanoví se gelovou elektroforézou na polyalaylamidu (2.2.31) za použití tyčinkového gelu délky 75 mm, průměru 5 mm a tlumivého roztoku trometamol-glycinového o pH 8,3. Elektroda v horní nádobě je katoda a v dolní nádobě anoda.
Použije se následující gelová směs: 1 objemový díl roztoku obsahujícího ve 100 ml 36,6 mg trometamolu R, 0,23 ml tetramethylethylendiaminu R a 48,0 ml kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS a 2 objemové díly roztoku obsahujícího ve 100 ml 0,735 g methylenbisakrylamidu R a 30,0 g akrylamidu R. Přidá se takové množství močoviny R, aby její koncentrace v konečném roztoku byla 480 g/l, a pak se roztok zředí na 7 objemových dílů vodou R. Jestliže je to nutné, zahřeje se nejvýše na 40 °C, aby se rozpustila močovina R. Po odplynění se přidá 1 objemový díl roztoku peroxodisíranu diamonného R (5,6 g/l).
Zkoušený roztok (a). 10 mg se rozpustí v 0,5 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l RS.
Zkoušený roztok (k). 0,25 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí hydroxidem sodným 0,01 mol/l RS na 5 ml.
Porovnávací roztok (a). Množství glukagonu CRL odpovídající 5 m.j. se rozpustí v hydroxidu sodném 0,01 mol/l PcS a zředí se jím na 25 ml.
Porovnávací roztok (b).8 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí hydroxidem sodným 0,01 mol/l RS na 10 ml.
Porovnávací roztok (c). 6 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí hydroxidem sodným 0,01 mol/l RS na 10 ml.
Porovnávací roztok (d). 4 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí hydroxidem sodným 0,01 mol/l RS na 10 ml.
Porovnávací roztok (e). 2 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí hydroxidem sodným 0,01 mol/l RS na 10 ml.
Na povrch gelu se nanese odděleně po 100 µl každého roztoku, přidá se tlumivý roztok a 0,2 ml modři bromfenolové RS. Elektroforéza probíhá při konstantním proudu 1 mA na trubici po dobu 30 min a pak se proud zvýší na 3 mA na trubici. Po skončení se gely ponoří do roztoku kyseliny trichloroctové R (125 g/l) nejméně na 1 h. Na každých 10 ml roztoku kyseliny trichloroctové se přidá 0,5 ml roztoku modři kyselé 90 R (2,5 g/l) a nechá se stát 12 h. Po odstranění barvícího roztoku se gely promyjí dvakrát směsí objemových dílů kyseliny octové R a vody R (1 + 4), která se vždy odstraní. Gely se uchovávají ve stejné směsi kyseliny octové R a vody R. Elektroforeogramy se pozorují za použití zdroje studeného světla. Na elektroforeogramech zkoušeného roztoku (a) žádná zóna, kromě zóny modři bromfenolové migrující v dvoj- až trojnásobku vzdálenosti hlavní zóny, není intenzívnější než hlavní zóna na elektroforeogramu porovnávacího roztok (e). Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (b) není žádná zóna migrující těsně před hlavní zónou intenzivnější než hlavní zóna na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže je patrna zóna na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (e) a je zřejmé odstupňování intenzity zbarvení na elektroforeogramech porovnávacích roztoků (a) až (e).
Dusík. 16,0 % až 18,5 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se mineralizací s kyselinou sírovou (2.5.9).
Zinek. Nejvýše 0,15 % Zn; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).
Zkoušený roztok. 50,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml. Je-li třeba, zředí se kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS tak, aby koncentrace zinku byla 0,4 µg/ml až 1, 6µg/ml.
Porovnávací roztoky. Použijí se čerstvě připravené roztoky obsahující 0,10 µg, 0,40 μg, 0,80 μg, 1,00 µg, 1,20 µg a 1,60 µg Zn v mililitru. K přípravě porovnávacích roztoků se použije základní roztok zinku (S mg Zn/ml), který se ředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS.
Měří se absorbance při 213,9 nm za použití zinkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a vzduch-acetylenového plamene vhodného složení (např. 21 acetylenu a 11 1 vzduchu za min).
Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 50,0 mg se suší 24 h v sušárně při 105 °C.
Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena pro výrobu parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.
Stanovení účinnosti
Účinnost se stanoví hodnocením vyvolaného hyperglykemického účinku za daných podmínek v porovnání s účinkem mezinárodního standardu nebo referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních j ednotkách.
Mezinárodní jednotka je specifická hyperglykemická účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaný glukagon s přídavkem laktosy a chloridu solného. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuj e Světová zdravotnická organizace.
Stanovená účinnost je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je v rozmezí 64 % až 156 % deklarované účinnosti.
Porovnávací roztok. Celý obsah ampule standardu se rozpustí ve 2 ml roztoku chloridu solného R (9 g/l), pH se upraví na hodnotu 3,0 kyselinou chlorovodíkovou R a zředí se stejným rozpouštědlem tak, aby roztok obsahoval např. 0,1 m.j v mililitru. Roztok se uchovává při 2 °C až 8 °C a použije se do 2 dnů.
Ke zkoušce se použijí zdraví králíci, jejichž rozdíl hmotnosti mezi nejlehčím a nejtěžším není větší než 1,2 kg (např. se použijí králíci o hmotnosti v rozmezí 1,8 kg až 2,8 kg). Zvířata se chovají v laboratoři v jednotných podmínkách a při jednotné dietě nejméně 1 týden před zkouškou. Vyžadují opatrné zacházení, aby se předešlo nežádoucímu vzrušení.
Každému králíkovi se 48 h před zkouškou nitrosvalově vstříkne 1 ml roztoku kortisonacetatu (25 g/l). Strava, kromě vody, se zvířatům nepodává 16 h před začátkem zkoušky, v čase zkoušky až do posledního odběru krve. Králici se rozděli náhodně do čtyř stejných skupin po nejméně čtyřech králících.
Připraví se dvě ředění porovnávacího roztoku s koncentrací v poměru 1 : 4, např. 0,006 m.j./ml (ředění porovnávacího roztoku 1) a 0,024 m.j./ml (ředění porovnávacího roztoku 2). Jako rozpouštědlo se použije roztok chloridu sodného R (9 g/l), jehož pH bylo upraveno na hodnotu 3,0 kyselinou chlorovodíkovou R. Pro rozpuštění zkoušené látky se použije stejného rozpouštědla a připraví se dvě ředění. U ředění zkoušeného roztoku 1 se na základě deklarované účinnosti předpokádá, že obsahuje stejný počet m.j. v mililitru jako ředění porovnávacího roztoku 1. U ředění zkoušeného roztoku 2 se předpokládá, že obsahuje stejný počet m.j./ml jako ředění porovnávacího roztoku 2. 1,0 ml každého ředění se vstříkne podkožně v pořadí uvedeném v následující tabulce. Druhá injekce se podává přibližně 24 h po první injekci.
| Skupina králíků | ||||
|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 1. injekce | porovnávací roztok - ředění 1 |
porovnávací roztok - ředění 2 |
zkoušený roztok - ředění 1 |
zkoušený roztok - ředění 2 |
| 2. injekce | zkoušený roztok - ředění 2 |
zkoušený roztok - ředění 1 |
porovnávací roztok - ředění 2 |
porovnávací roztok - ředění 1 |
Vzorky krve se odebírají z marginální ušní žíly každého králíka. 1 h po každé injekci se odebere vhodný vzorek krve a v každém vzorku se stanoví koncentrace glukosy. Optimální doba odběru závisí na chovu. Důležité při zkoušce j e, aby byl pro každého králíka zachován stejný časový interval. Účinnost se vypočítá běžnou statistickou metodou pro párový křížový pokus.
Uchovávání
Ve vzduchotěsných obalech, při teplotě pod 8 °C, přednostně při -20
°C.
Separandum.
Označování
V označení na obalu se uvede: