Insulinum humanum

Lidský insulin

1999

Je to protein se strukturou antidiabetického hormonu produkovaného lidskou slinivkou břišní. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 95,0 % až 105,0 % lidského insulinu C₂₅₇H₃₈₃N₆₅O₇₇S₆ a lidského A21 deamidoinsulinu. 1 m.j. insulinu odpovídá 0,0347 mg lidského insulinu.

Výroba

Lidský insulin je vyráběn za podmínek minimalizujících mikrobiální znečištění. Vyrábí se bud' enzymatickou přeměnou a vhodným čištěním insulinu získaného z prasečí slinivky břišní, nebo metodou založenou na rekombinantní DNK (rDNK) technologii. Lidský insulin vyráběný rDNK technologií odpovídá článku Producta ab ADN recombinante.

U lidského insulinu vyráběného enrymatickou přeměnou insulinu získaného z prasečí slinivky se ve validovaném výrobním procesu odstraňuje zbytková proteolytická účinnost. Oprávěná autorita může požadovat dodatečné zkoušky.

U lidského insulinu vyráběného rDNK technologii se neprovádí následující zkouška u každé šarže konečného výrobku, pokud oprávněná autorita neudělila výjimku.

Bílkoviny hostitelské buňky. Nejvýše 10 µg/g; stanoví se postupem uvedeným v článku Producta ab ADN recombinante.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, v ethanolu a v etheru. Rozpouští se ve zředěných minerálních kyselinách a za rozkladu ve zředěných alkalických hydroxidech.

Zkoušky totožnosti

1. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
2. Provede se peptidové mapování.

   Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS tak, aby obsahoval 2,0 mg/ml lidského insulinu a 500 µl tohoto roztóku se převede do čisté zkumavky. Přidají se 2,0 ml tlumivého roztoku HEPES o pH 7,5 a 400 µl roztoku proteasy kmene V8 zlatého stafylokoka R (1 mg/ml). Zkumavka se uzavře a inkubuje se 6 h při 25 °C. Reakce se zastaví přidáním 2,9 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0.

   Porovnávací roztok. Připraví se současně stejným způsobem jako zkoušený roztok za použití lidského insulinu CRL místo zkoušené látky.

   Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,1 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (3 µm),
• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
  • mobilní fáze A - smíchá se 100 ml acetonitrilu pro chromatografii R, 700 ml vody R a 200 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0, směs se zfiltruje a odplyní,
  • mobilní fáze B - smíchá se 400 ml acetonitrilu pro chromatografii R, 400 ml vody R a 200 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0, směs se zfiltruje a odplyní,

  Eluční podmínky jsou popsány v níže uvedené tabulce (pokud je třeba, upraví se gradient k dělení enzymaticky štěpeného insulinu):

  Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámky
  0 - 60	90 → 30	10 → 70	lineární gradient
  60 - 65	30 → 0	70 → 100	lineární gradient
  65 - 70	0	100	izokraticky

• spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Kolona se ustaluje při počátečních podmínkách nejméně 15 min. Provede se slepá zkouška za výše uvedeného gradientu.

Nastříkne se 50 µl zkoušeného roztoku a 50 µl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogram obou roztoků kvalitativně odpovídá referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného lidského insulinu. Na chromatogramu porovnávacího roztoku se určí totožnost píků štěpením vzniklých fragmentů I, II a III. Faktor symetrie píků fragmentu II a III je nejvýše 1,5 a rozlišení mezi dvěma píky je nejméně 3,4.

Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku.

Poznámka: Retenční čas fragmentu I prasečího insulinu je stejrrý jako pro lidský insulin. Retenční čas fragmentu II je stejný pro všechny insuliny. Retenční čas fragmentu III hovězího insulinu je stejný jako pro prasečí insulin.

Zkoušky na čistotu

Nečistoty s molekulovou hmotností větší než insulin. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 4 mg se rozpustí v 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0, 01 mol/l RS.

Roztok pro rozlišení. Použije se roztok insulinu (asi 4 mg/ml), který obsahuje více než 0,4 % vysokomolekulárních bílkovin. Mohou být použity injekční přípravky insulinu, roztok nebo suspenze, která se vyčeří dostatečným množstvím kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l RS, obsahující určité procento vysokomolekulárních bílkovin, nebo roztoky připravené z insulinu rozpuštěním v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Insulin obsahující určité procento vysokomolekulárních bílkovin může být připraven tak, že se prášek insulinu asi 10 dní nechá stát při pokojové teplotě.

Roztoky se udržují při teplotě 2 °C až 10 °C a použijí se do 7 dnů. Při použití automatického dávkovače se jeho teplota nastaví na 2 °C až 10 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru nejméně 7,5 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R (5 p.m až 10 p, m), vhodného stupně pro separaci monomerního insulinu z dimeru a polymerů,
• mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs objemových dílů kyseliny octové ledové R, acetonitrilu R a roztoku argininu R (1,0 gn) (15 + 20 + 65), průtoková rychlost je 0,5 ml/min,
• spektrofotometrického detektoru, 276 nm.

Ustalování kolony. Před použitím nové kolony pro chromatografickou analýzu se ustaluje rovnováha opakovaným nástřikem roztoku insulinu obsahujícího vysokomolekulární bílkoviny. Nejméně třikrát se nastříkne roztok pro rozlišení. Kolona je ustálená, když výsledky dvou po sobě následujících nástřiků jsou opakovatelné.

Nastříkne se 100 µl roztoku pro rozlišení. Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek retenční časy jsou: polymemí komplex insulinu 13 min až 17 min, kovalentní dimer insulinu asi 17,5 min, monomerní insulin asi 20 min, soli asi 22 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení, definované poměrem výšky píku dimeru k výšce minima mezi píky monomeru a dimeru, je nejméně 2,0.

Nastříkne se 100 µl zkoušeného roztoku. Chromatogram se zaznamenává asi 35 min. Na získaném chromatogamu součet ploch píků s retenčním časem kratším než retenční čas hlavního píku není větší než 1,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k píku s retenčním časem delším než retenční čas píku insulinu.

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) způsobem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu, s elučními podmínkami popsanými v následující tabulce:

Roztoky se udržují při 2 °C až 10 °C a použijí se do 24 h. Zkontroluje se způsobilost systému (rozlišení, linearita) způsobem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu. Pokud je třeba, upraví se relativní poměry mobilních fází tak, aby se zajistila úplná eluce prasečího A21 deamidoinsulinu před začátkem gradientu. Profil gradientu může být upraven tak, aby se zajistila eluce všech příbuzných nečistot insulinu.

Nastříkne se 20 µl porovnávacího roztoku (a), 20 µl porovnávacího roztoku (b), 20 µl porovnávacího roztoku (c) a 20 µl zkoušeného roztoku. Je-li třeba, upraví se nastřikovaný objem na objem mezi 10 µl a 20 µl v souladu s výsledky získanými pro zkoušku linearity popsanou ve Stanovení obsahu. Chromatogramy se zaznamenávají asi 50 min. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) se objeví lidský A21 deamidoinsulin jako malý pík za hlavním pikem s relativním retenčním časem asi 1,3 vzhledem k hlavnímu píku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku lidského A21 deamidoinsulinu není větší než 2,0 % z celkové plochy píků; součet ploch všech píků, kromě lidského insulinu a lidského A21 deamidoinsulinu, není větší než 2,0 z celkové plochy píků. Pouze pro semisyntetický lidský insulin: na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku odpovídající hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) není větší než plocha odpovídajícího píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) (1,0 prasečího insulinu v lidském insulinu).

Imunoreaktivita proinsulinu (PLI). Nejvýše 10 µg/g; počítáno na vysušenou látku. Imunoreaktivita proinsulinu se zkouší vhodnou imunochemickou, dostatečně citlivou metodou (2.7.1), např. radioimunoanalýza. Pro lidský insulin vyráběný enzymatickou přeměnou prasečího insulinu se ke kalibraci metody použije mezinárodní referenční látka pro prasečí proinsulin. Pro lidský insulin vyráběný rDNA technologií se ke kalibraci metody použije mezinárodní referenční látka pro lidský proinsulin.

Zinek. Nejvýše 1,0 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. 50,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml. Je-li třeba, zředí se kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na koncentraci např. 0,4 pg Zn/ml až 1,6 pg Zn/ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se roztoky obsahující 0,40 Frg Zn/tnl, 0,80 pg Zn/ml, 1,00 pg Znlml, 1,20 pg Znlml, 1,60 pg Zn/ml za použití čerstvě připraveného základního roztoku zinku (S mg Zn/ml) zředěním kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mohl RS.

Měří se absorbance při 213,9 nm za použití zinkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen vhodného složení (např. 1 1 vzduchu/min a 21 acetylenu/min).

Ztráta sušením (2.2.32).. Nejvýše 10,0 °Io; 0,200 g se suší 24 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 2,5 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se s 0,200 g zkoušené látky.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 10 m.j. endotoxiny v miligramu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 40,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 moh/l RS a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). Obsah lahvičky lidského insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí tak, aby výsledný roztok obsahova14,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (b). Obsah lahvičky prasečího insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí tak, aby výsledný roztok obsahova14,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (c). 1,0 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 50,0 ml. K 1,0 ml tohoto roztoku se přidá 1, 0 ml porovnávacího roztoku (a).

Porovnávací roztok (d). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 10,0 ml.

Roztok pro rozlišení. 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se smíchá s 1,0 ml porovnávacího roztoku (b).

Roztoky se udržují při teplotě 2 °C až 10 °C a použijí se do 48 h. Při použití automatického dávkovače se jeho teplota nastaví na 2 °C až 10 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• ocelové nerezové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm);
• mobilní fáze, kterou jsou následující roztoky připravené a uchovávané při teplotě nejméně 20 °C, průtoková rychlost je 1 ml/min;
  • mobilní fáze A - 28,4 g síranu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml. Přidá se 2,7 ml kyseliny fosforečné R a, je-li třeba, upraví se pH na hodnotu 2,3 ethanolaminem R, zfiltruje se a roztok se odplyní;
  • mobilní fáze B - 550 ml mobilní fáze A se smíchá s 450 ml acetonitrilu R. Roztok se zahřeje na teplotu nejméně 20 °C, aby se předešlo srážení (smíchání mobilní fáze A s acetonitrilem je endotermická reakce). Zfiltruje se a roztok se odplyní;
• spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Kolona se promývá směsí objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (42 + 58). V případě potřeby se upraví složení mobilní fáze.

Nastříkne se 20 µl roztoku pro rozlišení a 20 µl porovnávacího roztoku (b). Zaznamená se chromatogram roztoku pro rozlišení až pik odpovídající hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je zřetelně viditelný. Na chromatogramu roztoku pro rozlišení se určí totož nost píků prasečího insulinu a lidského insulinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídající lidskému insulinu a prasečímu insulinu je nejméně 1,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi tak, aby bylo dosaženo předepsaného rozlišení.

Nastříkne se 20 µl zkoušeného roztoku, 20 µl porovnávacího roztoku (a) a 20 µl porovnávacího roztoku (d). Zkoušku lze hodnotit, jestliže plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je (10 ± 0,5)násobekem plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (d). Pokud je tato zkouška neúspěšná, upraví se nastřikovaný objem na 10 µl až 20 µl, aby byl lineární rozsah detektoru.

Vypočítá se obsah lidského insulinu C257H383N₆₅O₇₇S6 a lidského A21 deamidoinsulinu z plochy hlavního píku a plochy píku lidského A21 deamidoinsulinu na chromatogramu zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (a) a deklarovaného obsahu lidského insulinu a lidského A21 deamidoinsulinu v lidském insulinu CRL.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při -20 °C do uvolnění pro výrobu. Po rozpuštění se insulin uchovává při (5 ± 3) °C po krátkou dobu, než bude použit pro výrobu přípravku. Při vážení je třeba insulin chránit před vzdušnou vlhkostí, insulin musí mít pokojovou teplotu.
Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• zda byla látka vyrobena enzymatickou přeměnou prasečího insulinu nebo rDNK technologií,
• zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.