Omega-3 acidorum esteri ethylici

1998

Ethylestery omega-3-kyselin

Jsou to estery, které se získávají esterifikací tělního oleje tučných druhů ryb patřících k čeledím jako Engaulidae, Carangidae, Clupeidae, Osmeridae, Salmonidae a Scrombroidae a následným fyzikálně-chemickým čistícím postupem, včetně močovinové frakcionace s následující molekulární destilací. Ethylestery omega-3-kyselin jsou definovány jako ethylestery kyseliny alfa-linolenové (C18:3 n-3), kyseliny moroktové (C18:4 n-3), C20:4 n-3, kyseliny timnodonové (ikosapentaenové) (C20:5 n-3; EPA), C21:5 n-3, kyseliny klupanodonové (C22:5 n-3) a kyseliny cervonové (dokosahexaenové) (C22:6 n-3; DHA). Celkový obsah ethylesterů omega-3-kyselin je nejméně 90 %. Obsah ethylesterů omega-3-kyselin EPA a DHA je nejméně 80 %, s nejméně 40 % ethylesterů EPA a nejméně 34 % ethylesterů DHA.

Jako antioxidační přísada se může přidat tokoferol.

Vlastnosti

Světle žlutá kapalina se slabým rybím pachem. Je prakticky nerozpustná ve vodě, velmi snadno rozpustná v acetonu, ethanolu, heptanu a methanolu.

Relativní hustota je asi 0,905.

Zkoušky totožnosti

Hodnotí se chromatogramy získané při stanovení obsahu ethylesterů EPA a DHA. Retenční časy a velikost píků odpovídajících ethylesteru kyseliny ikosapentaenové a ethylesteru kyseliny dokosahexaenové na chromatogramu zkoušeného roztoku jsou přibližně shodné s retenčním časem odpovídajících píků na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Číslo anisidinové. Nejvýše 20,0.

Číslo anisidinové je definováno jako stonásobek absorbance roztoku obsahujícího 1 g zkoušené látky ve 100 ml směsi rozpouštědel a zkoumadel, měřené v lcm kyvetě podle dále popsané metody.

Zkouška se provádí co nejrychleji za ochrarry před aktinickým světlem.

Zkoušený roztok (a). 0,500 g zkoušené látky se rozpustí v trimethylpentanu R a zředí se jím na 25,0 ml.

Zkoušený roztok (b). K 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 1,0 ml roztoku p-anisidinu R (2,5 g/l) v kyselině octové ledové R, protřepe se a chrání se před světlem.

Porovnávací roztok. K 5,0 ml trimethylpentanu R se přidá 1,0 ml roztoku p-anisidinu R (2,5 gn) v kyselině octové ledové R, protřepe se a chrání se před světlem.

Měří se absorbance zkoušeného roztoku (a) při 350 nm za použití trimethylpentanu RI jako kontrolní kapaliny. Měří se absorbance zkoušeného roztoku (b) při 350 nm přesně 10 min po jeho přípravě za použití porovnávacího roztoku jako kontrolní kapaliny.

Číslo anisidinové se vypočítá podle vzorce:

v němž značí:

A_s - absorbance zkoušeného roztoku (b) při 350 nm,
A_b - absorbance zkoušeného roztoku (a) při 350 nm,
m - hmotnost zkoušené látky ve zkoušeném roztoku (a) v gramech.

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 10,0.

Oligomery. Nejvýše 1,0 %. Zkoušf se vylučovací chromatografií (2.2.30).

Zkoušený roztok. 10,0 mg zkoušené látky se naváží do 10ml odměrné baí~ky, rozpustí se v tetrahydrofuranu R a zředí se jfm na 10,0 ml.

Porovnávací roztok. 15,0 mg ethylesteru kyseliny dokosahexaenové CRL a 15,0 mg polystyrenu 900-1000 R se rozpustí v tetrahydrofuranu R a zředí se jím na 20,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• gelové prostupné kolony 0,3 m dlouhé a vnitřním průměru 7,8 mm naplněné styren-divinylbenzenovým kopolymerem R (velikost pórů 10 nm, velikost částic 7 pm) a dvou gelových prostupných kolon 0,3 m dlouhých o vnitřním průměru 7,8 mm naplněných styrendivinylbenzenkopolymerem R (velikost pórů 50 nm, velikost částic 7 um) (tyto kolony se umístí nejblíže k dávkovači),
• tetrahydrofuranu R jako mobilní fáze o průtokové rychlosti 0,8 ml/min,
• diferenciálního refraktometru jako detektoru,
• integrátoru.

Nastříkne se 40 µl zkoušeného roztoku. Obsah oligomerů v procentech se vypočítá podle vzorce:

v němž značí:

A - součet ploch všech píků na chromatogramu,
B - součet ploch píků s retenčním časem menším než retenční čas ethylesterového píku (píků).

Ethylesterový pík(píky), který může být přítomen ve formě jednoduchého píku nebo nerozděleného dvojitého píku, jsou identifikovány jako hlavní píky) na chromatogramu viz obrázek 1. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku jsou dva píky odpovídající polystyrenu a ethylesteru DHA, jejichž plocha představuje nejméně 90 % součtu ploch všech píků na chromatogramu. Jestliže byla použita metoda standardního přídavku ke zkoušenému roztoku, je výtěžnost nejméně 95 % pro přidaný ethylester kyseliny ikosapentaenové CRL nebo ethylester kyseliny dokosahexaenové CRL. Nepřihlíží se k píku rozpouštědla.

Obr. 1. Chromatogram ke zkoušce Oligomery

Konjugované dieny. Nejvýše 1,5 %;provede se absorpční spektrofotometrie v ultra%alové oblasti (2.2.25).

Zkouška se provádí co možná nejrychleji za ochrany před aktinickým světlem, oxidačními činidly, oxidačními katalyzátory (například měd' a železo) a vzduchem.

Zkoušený roztok. 0,200 g až 0,800 g zkoušené látky se rozpustí v trimethylpentanu Rl a zředí se jím na 50,0 ml.

Měří se absorbance při 233 mn za použití spektrofotometru. Koncentrace roztoku se v případě potřeby upraví tak, aby hodnota absorbance byla 0,2 až 0, 8. Obsah konjugovaných dienů v procentech se vypočítá podle vzorce:

0,91 ·		A	- 0,07		,
		C

v němž značí:

A - absorbance při 233 nm,
C - koncentrace zkoušeného roztoku v gramech na litr,
0,91 - konverzní faktor,
0,07 - korekční faktor pro absorbanci esterové skupiny při 233 nm.

Stanovení obsahu

Ethyestery EPA a DHA. Zkouška se provádí co nejrychleji za ochrany před aktinickým světlem, oxidačními činidly, oxidačními katalyzátory (například měď a železo) a vzduchem.

Provede se plynová chromatografie (2.2.28).

Ve zkoušené látce se stanoví ethylestery kyseliny all-cis-5,8, 11,14, 17-ikosapentaenové (EPA; 20:5 n-3) a kyseliny all-cis-4,7, 10,13,16, 19-dokosahexaenové (DHA; 22:6 n-3).

Vnitřní standard. Methyltrřkosanoat R.

Zkoušený roztok. 0,17 g zkoušené látky a asi 70,0 mg vnitřního standardu se v l Oml odměrné baňce rozpustí v trimethylpentanu R obsahujícím 50 mg/l butylhydroxytoluenu R a zředí se stejným roztokem na 10,0 ml.

Porovnávací roztok. 55,0 mg ethyldokosahexaenoatu CRL, asi 70,0 mg vnitřního standardu a 88,0 mg ethylikosapentaenoatu CRL se rozpustí v 10ml odměrné baňce v trimethylpentanu R obsahujícím 50 mg/l butylhydroxytoluenu R v litru a zředí se stejným roztokem na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• křemenné kapilární kolony délky nejméně 30 m a vnitřního průměru 0,25 mm se stěnou pokrytou makrogolem 20 000 R (tloušťka filmu 0,25 μm),
• vodíku pro chromatografii R nebo helia pro chromatografii R jako nosného plynu s použitím promývacího zařízení na odstranění kyslíku,
• plamenoionizačního detektoru,  
• vhodného integrátoru,
• injektoru s děličem 1 : 200,

Teplota kolony se 0,5 min udržuje na 170 °C, pak se zvyšuje rychlostí 10 °C/min na 240 °C a 22 min se udržuje na 240 °C; teplota vstřikovacího prostoru je 250 °C a teplota detektoru je 280 °C.

Nastříkne se dvakrát po 1 µl každého roztoku.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku jsou tři píky odpovídající ethylesteru EPA, methyltrikosanoatu a ethylesteru DHA, viz obrázek 2 a obrázek 3. Jestliže byla použita metoda standardního přídavku ke zkoušenému roztoku, je výtěžnost nejméně 95 pro přidaný ethylikosapentaenoat CRL nebo ethyldokosahexaenoat CRL, když byla patřičně vzata v úvahu korekce u vnitřního standardu. . .

Vypočítá se obsah ethylesterů EPA a DHA v procentech a k výpočtu se použijí stanovené hodnoty ethylikosapentaenoatu CRL a ethyldokosahexaenatu CRL podle vzorce:

kde Rf, x je odezvový faktor:

v němž značí:

M_r - hmotnost vnitřního standardu ve zkoušeném roztoku v miligramech,
m₂ - hmotnost zkoušené látky ve zkoušeném roztoku v miligramech,
m₃ - hmotnost vnitřního standardu v porovnávacím roztoku v miligramech,
m_x, - hmotnost ethylikosapentaenoatu CRL nebo ethyldokosahexaenoatu CRL v porovnávacím roztoku v miligramech,
A_x - plochu píku odpovídající ethylikosapentaenoatu nebo ethyldokosahexaenoatu ve zkoušeném roztoku,
A_{x, r} - plochu píku odpovídající ethylikosapentaenoatu nebo ethyldokosahexaenoatu v porovnávacím roztoku,
A₁ - plochu píku odpovídající methyltrikosanoatu ve zkoušeném roztoku,
A₂ - plochu píku odpovídající methyltrikosanoatu v porovnávacím roztoku. 

Obr. 2. Chromatogram ke zkoušce Ethylestery EPA a DHA

Obr. 3. Chromatogram ke zkoušce Ethylestery EPA a DHA

Celkové ethylestery omega-3kyselin. Ze stanovení obsahu ethylesterů EPA a DHA se vypočítá obsah celkových ethylesterů omega-3-kyselin v procentech podle vzorce:

v němž značí:

Uchování

Ve zcela naplněných vzduchotěsných obalech pod interním plynem, za ochrany před světlem.

Označování

V označení na obalu se uvede, zda látka obsahuje tokoferol jako antioxidační přísadu.