Urokinasum

Urokinasa

Je to enzym získaný z lidské moči, který aktivuje plazminogen. Skládá se ze směsi nízkomolekulárních (M 33 000) a vysokomolekulárních (Mr 54 000) forem, přičemž vysokomolekulární forma převažuje. Účinnost je nejméně 70 000 mezinárodních jednotek v miligramu bílkoviny.

Výroba

Připravuje se validovanými výrobními postupy, které omezují nebo vylučují kontaminaci mikroby a viry a vazoaktivními látkami. Zvláště k inaktivaci virů se užívají přiměřené postupy, jako je zahřívání roztoku látky na 60 °C po dobu 10 h.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý amorfní prášek. Je rozpustná ve vodě.

Zkoušky totožnosti

1. Do dvou hemolytických zkumavek se napipetuje odděleně po 0,5 ml citrátové lidské plazmy a 0,5 ml citrátové hovězí plazmy a zahřívá se ve vodní lázni při 37 °C. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml roztoku zkoušené látky v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,4 (1000 m.j./ml) a 0,1 ml roztoku thrombinu lidského R (20 m.j./ml) v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,4 a ihned se zamíchá. V obou zkumavkách se tvori sraženina, která se rozpustí během 30 min.
2. Provede se zkouška totožnosti vhodnou imunodifuzní metodou.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 10 mg se rozpustí v 10 ml vody R. Roztok je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Povrchový anfigen hepatitidy B. Zkouší se vhodnou citlivou metodou, jako je radioimunoanalýza.

Povrchový antigen hepatitidy B se neprokáže.

Tromboplastické nečistoty.

Zkoušené roztoky. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí v tlumivém roztoku barbitalovém o pH 7,4 tak, aby získané roztoky měly účinnost 5000 m.j., 2500 m.j., 1250 m.j., 625 m.j. a 312 m.j . v mililitru.

Do každé ze šesti hemolytických zkumavek o vnitřním průměru 1 cm se odměří 0,1 ml citrátové králičí plazmy R. Zkoušené roztoky se po 0,1 ml přidají do každé z pěti zkumavek a do šesté zkumavky se přidá 0,1 ml tlumivého roztoku barbitalového o pH 7,4 (slepá zkouška). Zkumavky se inkubují 5 min při (25 + 0,5) °C a pak se přidá 0,1 ml roztoku chloridu vápenatého R (3,675 g/l). Stopkami se změří koagulační čas pro každou zkumavku. Do grafu se vynáší zkracování rekalcifikačního času (rozdíl srážecího času slepé zkoušky a srážecího času měřeného vzorku) proti 10garitmu koncentrace v mezinárodních jednotkách. Pěti vynesenými body se proloží přímka a extrapoluje se k nulovému rekalcifikačnímu času.

Urokinasová účinnost v průsečíku, který představuj e limitní koncentraci pro koagulační aktivitu (nulová koagulační aktivita), je nejméně 150 m.j. v mililitru.

Molekulová frakce. Zkouší se vylučovací chromatografií (2.2.30).

Zkoušený roztok. Asi 1 mg zkoušené látky se rozpustí v 1,0 ml tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 8, D (0,02 mol/l). Připravuje se těsně před použitím.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• kolony délky 0,9 m a vnitřního průměru 16 mm naplněné dextranem pro chromatografii síťovaným R3,
• mobilní fáze, kterou je roztok chloridu sodného R (17,5 g/l) v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 8,0 (0,02 mol/l), s průtokovou rychlostí 6 mUh.

Po ustálení kolony při 5 °C se převede zkoušený roztok do vstupu kolony a zbytky vzorku se spláchnou dvakrát 0,5 ml mobilní fáze a provede se eluce. Eluát se jímá po částech o objemu 1 ml, měří se Absorbance (2.2.25) eluátů v maximu při 280 nm a jednotlivé hodnoty se zakresli do grafu. Spustí se kolmice k osám přímek z minima před vrcholem vysokomolekulární formy, mezi vrcholy obou forem a za vrcholem nízkomolekulární formy a takto se identifikují frakce, které jsou uvažovány ve výpočtu poměru účinnosti obou forem. Spojí se zvlášť frakce vysokomolekulární formy a zvlášť frakce níZkomolekulárnífoany. Odděleně se stanoví urokinasová účinnost v mezinárodních jednotkách pro každou spojenou frakci, a to metodou popsanou v odstavci Stanovení účinnosti. Poměr urokinasové účinnosti spojených frakcí vysokomolekulárnífoany k účinnosti spojených frakcí nízkomolekulární formy je nejméně 2,0.

Celková bílkovina. Stanoví se obsah dusíku mineralizací 10 mg zkoušené látky kyselinou sírovou (2.5.9) a celkový obsah bílkoviny se vypočítá vynásobením faktorem 6,25.

Sterilit$ (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti.

Účinnost se stanoví porovnáním schopnosti zkoušené látky aktivovat plazminogen k tvorbě plazminu se stejnou schopností referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách. Tvorba plazminu se měří stanovením doby rozpouštění fibrinové sraženiny za daných podmínek.

Mezinároďní jeďnotkou je účinnost obsažená v určitém množství mezinároďního referenčního přípravku, kterým je lyofilizovaná urokinasa s laktosou. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Pokud není uvedeno jinak, použije se pro přípravu roztoků a ředění použitých v tomto stanovení roztok albuminu hovězího R (30 g/l) v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,4.

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky tak, aby jeho předpokládaná účinnost byla asi 1000 m.j./ml.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok referenčního přípravku tak, aby jeho účinnost byla 1000 m.j./ml.

Zkoušený a porovnávací roztok se uchovávají v ledové lázni a lze je použít do 6 h od přípravy. Připraví se tři 1, Snásobná ředění porovnávacího roztoku tak, aby nejdelší doba rozpouštění sraženiny byla nejvýše 20 min a nejkratší doba nejméně 3 min. Dále se připraví 3 vzorky zkoušeného roztoku s podobným ředěním. Připravené roztoky se uchovávají v ledové lázni a použijí se do 1 h. Připraví se 24 zkumavek o průměru 8 mm. Zkumavky se označí T 1, TZ a T3 pro ředění zkoušeného roztoku a S 1, SZa S3 pro ředění porovnávacího vzorku, přičemž se použijí 4 Zkumavky pro každé ředění. Do každé ze zkumavek umístěných v ledové lázni se pipetuje 0,2 ml příslušného ředění, 0,2 ml roztoku albuminu hovězího R (30 g/l) v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,4 a 0,1 ml roztoku trombinu lidského R o účinnosti nejméně 20 m.j./ml. Zkumavky se poté umístí do vodní lázně o teplotě 37 °C a inkubují se 2 min k vyrovnání teploty. Pomocí automatické pipety se pipetuje na dno 1. zkumavky 0,5 ml roztoku euglobulinů hovězích R (10 g/l) a obsah se promíchá. V intervalech 5 s se do zbylých zkumavek pipetuje po 0,5 ml roztoku ytovězích euglobulinů R (10 g/l). Stopkami se měří čas v sekundách pro každou zkumavku mezi přidáním roztoků euglobulinů a rozpuštěním sraženiny. Do grafu se vynáší 10garitmus rozpouštěcího času pro zkoušenou látku a pro referenční přípravek proti 10garitmu koncentrace. Pomocí běžných statistických metod se vypočítá účinnost zkoušené látky. Stanovená účinnost je 90 % až 111% deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P= 0,95) je 80 % až 125 % deklarované účinnosti.

Uchovávání

V dobře uzavřeném obalu, chráněna před světlem, při teplotě nepřesahující 8 °C. Pokud je látka sterilní, uchovává se ve sterilním vzduchotěsném zabezpečeném obalu.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• účinnost v mezinárodních jednotkách v miligramu bílkoviny,  
• zda je obsah sterilní,
• zda je obsah prostý pyrogenních látek.