Somatropinum pro iniectione

R99

Somatropin pro injekci

Je to lyofilizovaný sterilní přípravek obsahující bílkovinu se strukturou (191 aminokyselinových zbytků) hlavní složky růstového hormonu produkovaného lidskou hypofýzou. Obsahuje 89,0 % až
105,0 % deklarovaného obsahu somatropinu (C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇). Vyhovuje požadavkům článků
Parenteralia a Producta ab ADN recombinante.

1 mg bezvodého somatropinu (C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇) odpovídá 3,0 mj. biologické účinnosti.

Výroba

Připravuje se bud' ze somatropinu, nebo z roztoku somatropinu, či metodou založenou na rekombinaci DNK (rDNK), při které je injekční přípravek připravován bez izolace pevných nebo tekutých meziproduktů. V posledním případě se při vývoji přípravku prokáže vhodnou validovanou metodou stanovení biologické účinnosti, založenou na stimulaci růstu a schválenou oprávněnou autoritou, že výrobní postup dává látku, jejíž biologická účinnost je nejméně 2,5 m .j. v miligramu. Přečištěný přípravek, k němuž se mohou přidávat tlumivé roztoky nebo stabilizační přísady, se filtruje filtrem zachycujícím bakterie, asepticky se rozplňuje do sterilních obalů ze skla třídy I (3.2.1) a lyofilizuje se. Obaly se ihned uzavřou tak, aby se vyloučila mikrobiální kontaminace a vniknutí vlhkosti.

Zkoušený přípravek vyhovuje následujícím dodatečným požadavkům.

Bílkoviny hostitelské buňky. Požadavek schválí oprávněná autorita.

DNK hostitelské buňky a vektoru. Požadavek schválí oprávněná autorita.

Kde se zkoušený přípravek připravuje ze somatropinu nebo z koncentrovaného roztoku somatropinu, nemusí výrobce při následující výrobě přípravku znovu ověřovat splnění požadavků na bílkoviny hostitelské buňky, DNK hostitelské buňky a vektoru a vyhovění zkoušce totožnosti C.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek.

Zkoušky totožnosti

1. Hodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Distribuce izoforem, viz Zkoušky na čistotu. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá hlavní zóna polohou hlavní zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).

2. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné bílkoviny, viz Zkoušky na čistotu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.
3. Provede se peptidové mapování.

   Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušeného přípravku v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/1) tak, aby obsahoval 2,0 mg somatropinu v mililitru. Asi 1,0 ml takto připraveného roztoku se přenese do zkumavky z vhodného materiálu, např. polypropylenu. Připraví se čerstvý roztok trypsinu pro peptidové mapování R (1 mg/ml) v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/Z) a 30 µl tohoto roztoku se přidá k roztoku zkoušené látky. Zkumavka se uzavře a vloží se na 4 h do vodní lázně 37 °C teplé. Potom se zkumavka vyjme z vodní lázně a ihned se probíhající reakce přeruší, např. zmražením. Je-li okamžitě použit automatický dávkovač, udržuje se teplota při 2 °C až 8 °C.

   Porovnávací roztok. Současně se za stejných podmínek připraví porovnávací roztok s tím rozdílem, že se zkoušená látka nahradí somatropinem CRL.

   Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   • nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 µm až 10 µm),
   • mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min: 
   • mobilní fáze A - 1 ml kyseliny trifluoroctové R se zředí vodou R na 1000 ml,
   • mobilní fáze B - ke 100 ml vody R se přidá 1 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem pro chromatografzi R na 1000 ml, použije se následující gradient (je-li třeba, gradient nebo teplota kolony se nastaví tak, aby se dosáhlo požadovaného rozdělení produktů enzymatického štěpení):
   
   

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)
   0 - 20	100 → 80	0 → 20
   20 - 40	80 → 75	20 → 25
   40 - 65	75 → 50	25 → 50
   65 - 70	50 → 20	50 → 80
   70 - 71	20 → 100	80 → 0
   71 - 85	100	0

   
   
   • spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

   Teplota kolony se udržuje při 30 °C.

   Kolona se nejméně 15 min ustaluje mobilní fází A. Provede se slepá zkouška za použití výše uvedeného gradientu.

   Nastříkne se odděleně po 100 µl každého roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogramy jednotlivých roztoků kvalitativně odpovídají referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného somatropinu. Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku.

4. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušeného přípravku v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Roztok pro rozlišení (validační směs somatropinu a deamidosomatropinu). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg. Zfiltruje se přes sterilní filtr nebo se přidá azid sodný R do koncentrace 0,1 mg v mililitru roztoku a nechá se 24 h stát při pokojové teplotě.

Roztoky se uchovávají při teplotě 2 °C až 8 °C a použUí se do 24 h. Pokud se používá automatický dávkovač je nutno jej udržovat při 2 °C až 8 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem butylsilanizovaným pro chromatografii R (velikost částic 5 µm a velikost pórů 30 mm), která se umístí mezi pumpu a nástřikový ventil,
• mobilní fáze, která je směsí objemových dílů propanolu R a tlumivého roztoku trometamolového o pH 7,5 (0,05 mol/l) (29 + 71); průtoková rychlost j e 0,5 ml/min,
• spektrofotometrického detektoru, 220 nm.

Teplota kolony se udržuje při 45 °C.

Před použitím se kolona promývá 200 ml až 500 ml 0,1% (V/V) roztoku kyseliny trifluoroctové R v 50% (V/V) roztoku acetonitrilu R. Je-li třeba, promývání se opakuje do ustálení kolony.

Nastříkne se 20 µl porovnávacího roztoku. Je-li třeba, upraví se koncentrace propanolu R v mobilní fázi tak, aby retenční čas hlavního píku byl asi 33 min.

Nastříkne se 20 µl roztoku pro rozlišení. Na chromatogramu se objeví malý pík (deamidosomatropin) s relativním retenčním časem k hlavnímu píku asi 0,85. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky somatropinu a deamidosomatropinu je nejméně 1,0 a hodnota faktoru symetrie píku somatropinu je 0,9 až 1,8.

Nastříkne se 20 µl zkoušeného roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 13,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k plkům rozpouštědel.

Dimer a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30), jak je popsána ve zkoušce Stanovení obsahu.

Nastříkne se 20 µl zkoušeného roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch píků s retenčním časem kratším, než je retenční čas hlavního píku, není větší než 6,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k pikům rozpouštědel.

Distribuce izoforem. Provede se izoelektrická fokusace.

Zkoušený roztok (a). Připraví se roztok zkoušeného přípravku v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Zkoušený roztok (b). K 0,1ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 1,9ml tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 7,0 (0,025 mol/l).

Porovnávací roztok (a). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok (b). Použije se roztok pro kalibraci izoelektrického bodu o rozmezí pH 2,5 až 6,5, připravený podle návodu výrobce.

Se zařízením se pracuje podle návodu výrobce. Izoelektrická fokusace se provádí na hotových deskách s vrstvou gelu o rozměrech 245 mm x 110 mm x 1 mm a pH v rozmezí 4,0 až 6,5. Na vrstvu gelu se nanese odděleně po 15 µl každého roztoku. Jako anodický roztok se použije roztok kyseliny glutamové R (14,7 g/1) v roztoku kyseliny fosforečné R (50 g H3P04/1) a jako katodický roztok se použije roztok f3-alaninu R (89,1 gfl). Pracovní podmínky se nastaví na 2000 V a 25 mA. Fokusace se nechá probíhat 2,5 h při konstantním napětí a příkonu nepřevyšujícím 25 W. Potom se vrstva gelu ponoří na 30 min do roztoku obsahujícího kyselinu trichloroctovou R (115 g/1) a kyselinu sulfosalicylovou R (34,5 g/1) a pak na 5 min do směsi objemových dílů kyseliny octové R, ethanolu R a deionizované vody R (8 + 25 + 67) (odbarvovací roztok). Vrstva gelu se zbarví ponořením na 10 min do 60 °C teplého roztoku modři kyselé 83 R (1,15 g/1) v odbarvovacím roztoku a potom se ponoří do odbarvovacího roztoku do odstranění nadbytku barviva.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozdělení zón na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (b) odpovídá pokynům výrobce. Na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a) je viditelná hlavní zóna s izoelektrickým bodem asi 5 a kyselejší menší zóna při asi 4,8. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) žádná zóna, kromě hlavní zóny, nepřevyšuje svou intenzitou hlavní zónu na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (b) (6,25 %).

Voda, mikrostanovení (2.5.32). Nejvýše 3,0 %, není-li předepsáno a schváleno jinak.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 5 m.j. endotoxinu v miligramu účinné látky.

Stanovení obsahu

Stanoví se vylučovací chromatografií (2.2.30).

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušeného přípravku v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/Z) tak, aby v mililitru obsahoval 1,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok. Obsah lahvičky somatropinu CRL se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/1) a zředí se stejným rozpouštědlem na koncentraci 1,0 mg/ml. Roztok pro rozlišení. Lahvička somatropinu CRL se nechá v sušárně při 50 °C po dobu (obvykle 12 h až 24 h) dostačující k vytvoření 1 % až 5 % dimeru. Obsah lahvičky se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/l) a zředí se stejným rozpouštědlem na koncentraci 1,0 mg/ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,30 m a vnitřního průměru 7,8 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografe R jakosti vhodné pro dělení globulárních bílkovin v rozmezí molekulové hmotnosti 5000 až 150 000.
• mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs objemových dílů 2 propanolu R a tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 7,0 (0,063 mol/l) (3 + 97); průtoková rychlost je 0,6 ml/min,
• spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Nastříkne se 20 µl roztoku pro rozlišení. Na získaném chromatogramu je retenční čas hlavního píku asi 12 min až 17 min a relativní retenční časy píku dimeru somatropinu a proteinů s vyšší molekulovou hmotností jsou 0,90 a 0,65, vztaženo k hlavnímu píku. Rozlišení dané poměrem výšky minima nad základní linií mezi píky monomeru a dimeru k výšce dimeru je nejvýše 0,4.

Nastřikuje se 20 µl zkoušeného roztoku a 20 µl porovnávacího roztoku.

Obsah somatropinu se vypočítá z ploch píků na chromatogramu zkoušeného roztoku a na chromatogramu porovnávacího roztoku a z deklarovaného obsahu látky C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇ v somatropinu CRL.

Uchovávání

Ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech, při teplotě 2 °C až 8 °C.
Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• obsah somatropinu v obalu v miligramech,
• složení a objem kapaliny přidané pro rekonstituci,
• doba, po kterou lze rekonstituovaný roztok použít, a podmínky uchovávání po tuto dobu,
• název a množství jakýchkoliv přísad,
• teplota uchovávání,
• že se přípravek při rekonstituci nemá třepat.