Vaccinum febris flavae vivum

1999

Živá vakcína proti žluté zimnici

Je to lyofilizovaný přípravek kmene 17D viru žluté zimnice (Flavivirus hominis) pomnoženého na kuřecích embryích. Vakcína se rekonstituuje bezprostředně před použitím předepsaným způsobem na čirou tekutinu.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou živou vakcínu proti žluté zimnici s přijatelnou imunogenitou a bezpečností pro člověka.

Výrobní metoda se validuje, aby se prokázalo, že bude-li přípravek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9) s následující úpravou zkoušky na morčatech: každému morčeti se vstříkne deset lidských dávek a pozorují se 21 dní.

Referenční přípravek. Ve zkoušce na neurotropismus se použije jako referenční přípravek taková šarže vakcíny, která byla s uspokojivými výsledky použita u člověka.

Substrát pro pomnožení viru

Virus pro přípravu matečného a pracovního inokula a všech šarží vakcíny se pomnožuje v tkáních kuřecích embryí z chovu kuřat prostého specifikovaných patogenů (5.2.2).

Inokula

Kmen 17D je určen podle původních záznamů, které obsahují informaci o původu kmene a následné manipulaci s ním. Inokula viru se připravují ve velkých množstvích a uchovávají se při teplotě pod -60 °C. Matečné a pracovní inokulum neobsahují žádnou lidskou bílkovinu ani přidané sérum.

Není-li jinak vysvětleno a schváleno, virus v konečné vakcíně je na úrovni 204. až 239. pasáže z původně izolovaného kmene 17D. Pracovní inokulum je pouze jedinou pasáží z matečného inokula. Pracovní inokulum se použije bez zprostředkující pasáže jako inokulum pro infikování tkání použitých k výrobě šarže vakcíny, aby bylo zajištěno, že vakcína byla vyrobena pouze jedinou pasáží z matečného inokula, které vyhovělo všem zkouškám na bezpečnost.

Pouze virové inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k pomnožení viru.

Zkouška totožnosti. V matečném a pracovním inokulu se virus žluté zimnice prokáže neutralizací sérem v buněčné kultuře za použití specifických protilátek.

Cizí agens (2.6.1). Každé pracovní inokulum vyhovuje následujícím zkouškám:

Bakterie a houby - sterilita
Mykoplazmata
Mykobakterie
Ptačí viry
Zkouška na dospělých myších (pouze intraperitoneální inokulace)
Zkouška na morčatech

Zkouška na opicích. Každé matečné a pracovní inokulum vyhovuje následujícím zkouškám na opicích na virémii (viscerotropismus), imunogenitu a neurotropismus.

Používají se opice druhu Macaca citlivé na virus žluté zimnice, které v době podání virové kultury nejsou prokazatelně imunní vůči žluté zimnici. Jsou zdravé a nebyly dříve intracerebrálně nebo intraspinálně očkovány. Mimo to nebyly očkovány jinými způsoby neurotropními viry nebo antigeny příbuznými viru žluté zimnice. Pro každou zkoušku se použije nejméně deset opic.

Použije se zkušební dávka 0,25 ml obsahující množství odpovídající nejméně 5000 myších LD50 a nejvýše 50 000 myších LD50, stanovená titrací infekčního viru a za použití stanoveného vztahu mezi koncentrací viru a myší LD50 (viz Stanovení účinnosti). Zkušební dávka se pod anestezií vstříkne každé opici do frontálního laloku a opice se pozorují nejméně 30 dní.

Virémie (Viscerotropismus). Viscerotropismus je určen množstvím viru obsaženého v séru. Druhý, čtvrtý a šestý den po inokulaci se každé zkoušené opici odebere krev a z každého vzorku se připraví sérum. Z každého séra se připraví ředění 1 : 10, 1 : 100 a 1 : 1000 a každé ředění se naočkuje do skupiny nejméně šesti nádob s buněčnou kulturou používanou ke stanovení virové koncentrace. Inokulum vyhovuje zkoušce, jestliže žádné sérum neobsahuje více než ekvivalent 500 myších LD50 v 0,03 ml a nejvýše jedno sérum obsahuje více než ekvivalent 100 myších LD50 v 0,03 ml.

Imunogenita. Za 30 dní od podání zkušební dávky se každé opici odebere krev a z každého vzorku se připraví sérum. Inokulum vyhovuje zkoušce, jestliže se nejméně 90 % zkoušených opic ukáže jako imunních, což se stanoví vyšetřením jejich séra v dále popsané zkoušce na neutralizaci viru žluté zimnice.

Ukázalo se, že malé ředění séra (např. 1 : 10) může obsahovat nespecifické inhibitory, které ovlivňují tuto zkoušku; takové sérum se upraví, aby se inhibitory odstranily. Alespoň ředění séra 1 : 10, 1 : 40 a 1 : 160 od každé opice se smíchají se stejným objemem kultury vakcinačního viru 17D na ředění, které poskytne nejvhodnější počet plaků při použité titrační metodě. Směsi séra s virem se 1 h inkubují ve vodní lázni při 37 °C a pak se ochladí ve vodě s ledem; po 0,2 ml směsi séra s virem se dá na čtyři misky s buněčnou kulturou a postupuje se jako při stanovení koncentrace viru. Podobně se naočkuje deset misek stejným množstvím virové kultury smíchané se stejným objemem zředěného 1 : 10 séra, o němž se ví, že neobsahuje žádné neutralizující protilátky proti viru žluté zimnice. Na konci pozorovací doby se porovná průměrný počet plaků na miskách obsahujících virovou kulturu a neimunní sérum s průměrným počtem plaků na miskách obsahujících virovou kulturu a jednotlivá ředění každého opičího séra. Nejvýše 10 % zkoušených opic má sérum, které při ředění 1 : 10 nestačí snížit počet plaků o 50 %.

Neurotropismus. Neurotropismus se stanoví z klinického pozorování encefalitidy, z výskytu klinických manifestací a histologických lézí při srovnání s deseti zvířaty očkovanými srovnávacím přípravkem. Virové inokulum není přijatelné, jestliže počet a trvání febrilních reakcí nebo klinických známek encefalitidy a patologické nálezy svědčí o změnách vlastnosti viru.

Klinické hodnocení. Opice se po 30 dní denně vyšetřují personálem dobře obeznámeným s klinickými příznaky encefalitidy u primátů (je-li třeba, opice se vyjmou z klecí a vyšetří se na příznaky motorické slabosti nebo křečí). Virové inokulum není přijatelné, jestliže opice po očkování vykazují známky encefalitidy, jako je paralýza nebo neschopnost stát po stimulaci, nebo je mortalita vyšší než u referenčního přípravku. Tyto a jiné příznaky encefalitidy, jako jsou parézy, nekoordinace, letargie, třes nebo křeče, jsou převedeny do číselných hodnot, aby se síla příznaků mohla vyjádřit postupnou řadou. Každý den se každá opice ohodnotí počtem bodů na základě stupnice:

stupeň 1 - zhrublá srst, nechuť k jídlu,
stupeň 2 - vysoko položený hlas, neaktivní, pomalu se pohybující,
stupeň 3 - rozechvění, třes, nekoordinace, únava končetin,
stupeň 4 - neschopnost vstát, paralýza končetin nebo smrt (mrtvé opice se denně ohodnotí 4 body ode dne úmrtí až do 30. dne).

Klinické hodnocení jednotlivé opice odpovídá průměru denního bodování: klinické hodnocení inokula je součtem bodů jednotlivých opic. Inokulum není přijatelné, jestliže průměr klinického hodnocení u skupin opic naočkovaných tímto inokulem je signifikantně vyšší (P = 0,95) než u skupiny opic naočkovaných referenčním přípravkem. Při posuzování přijatelnosti inokula se bere ohled i na jednotlivá zvířata s neobvykle prudkými příznaky.

Histologické hodnocení. Vyšetřuje se těchto pět oblastí mozku:
blok I - corpus striatum v překřížení zrakových nervů,
blok II - thalamus v úrovni mamilárních tělísek,
blok III - mesencephalon v oblasti colliculus superior,
blok IV - most a mozeček v oblasti oliva superior,
blok V - prodloužená mícha a mozeček v oblasti nucleus olivaris acc medialis.

Krční a bederní ztluštění páteřní míchy se každé rozdělí do šesti bloků: 15 µm řezy z tkáně zalité v parafinu se barví gallocyaninem. Numerické hodnocení každého řezu míchy a struktur v každém řezu mozku je uvedeno níže. Léze jsou hodnoceny následovně:
Stupeň 1 - minimální - 1 až 3 malé ohniskové zánětlivé infiltráty. Degenerace nebo ztráta několika neuronů.
Stupeň 2 - střední - 4 nebo více ohniskových zánětlivých infiltrátů. Degenerace nebo ztráta neuronů postihující nejvýše jednu třetinu buněk.
Stupeň 3 - těžký - střední ohniska nebo difuzní zánětlivé infiltráty. Degenerace nebo ztráta dvou třetin neuronů.
Stupeň 4 - záplava - různé, ale často prudké zánětlivé reakce. Degenerace nebo ztráta více než 90% neuronů.

Bylo zjištěno, že inokulace vakcíny proti žluté zimnici do opičího mozku způsobuje léze v různých anatomických útvarech centrální nervové soustavy o různé frekvenci a síle (I. S. Levenbook et al., Journal of Biological Standardization, 1987, 15, 305-313). Na základě těchto dvou indikátorů se anatomické struktury mohou podle histologického hodnocení zařadit do tří skupin - cílová, chráněná a výběrová. Cílové zóny vykazují silné specifické léze u většiny opic bez ohledu na stupeň neurovirulence inokula. Chráněné zóny vykazují minimální specifické léze u menšiny zvířat. Výběrové zóny vykazují velmi signifikantní nárůst výskytu výrazných specifických lézí v závislosti na stupni neurovirulence inokula. Výběrové a cílové zóny pro opice Macaca cynomolgus a Macaca rhesus jsou uvedeny v tabulce.

Bodové hodnocení výběrové a cílové zóny se použije pro konečné hodnocení inokula. Pro hodnocení jednotlivých opic se sečtou počty reakcí v cílové zóně v každém řezu odděleně podle počtu zkoumaných oblastí. Podobně se vypočítá samostatné hodnocení pro výběrové zóny.

Průměr bodů pro zkoušenou skupinu se vypočítá dvěma způsoby: 1) dělením celkového počtu výběrových zón počtem opic; 2) dělením celkového počtu cílových a výběrových zón počtem opic. Tato dvě hodnocení je možno použít při rozhodování o vhodnosti inokula. Inokulum není možno použít, jestliže počet lézí je signifikantně vyšší (P = 0,95) než u skupiny opic inokulovaných referenčním přípravkem.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny práce s kuřecími embryi se provádějí za aseptických podmínek v prostředí, kde se ve stejnou dobu nepracuje s jiným infekčním agens ani s jinými buňkami. Dvě procenta, ale nejméně dvacet embryí a nejvýše padesát embryí se ponechá jako neinfikovaná kontrola embryí. Po inokulaci a inkubaci v kontrolované teplotě se sklízí jen živá a typická embrya. Stáří embrya v době sklizně viru se odhadne z původního vložení vajec do inkubátoru a mělo by být nejvýše 12 dní. Po homogenizaci a vyčeření odstředěním se výtažek z embryonální dřeně zkouší, jak je popsáno dále, a do dalšího zpracování se uchovává při -70 °C nebo nižší teplotě. Virové sklizně, které vyhoví předepsaným zkouškám, se mohou smíchat. K virové suspenzi se v žádném stupni v průběhu výroby nepřidává žádná lidská bílkovina. Pokud se přidávají stabilizátory, pak prokazatelně nemají na člověka žádné antigenní ani senzibilizující působení.

Pouze jednotlivá sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny.

Zkouška totožnosti. Jednotlivá sklizeň obsahuje viry, které se prokážou jako virus žluté zimnice v buněčné kultuře neutralizací specifickými protilátkami.

Cizí agens (2.6.16). Jednotlivá sklizeň vyhovuje ve zkouškách na cizí antigeny. Kontrolní vejce (2.6.16).

Kontrolní vejce vyhovují ve zkouškách na cizí antigeny.

Koncentrace viru. Aby se mohlo vypočítat ředění pro konečnou várku vakcíny, zkouší se každá jednotlivá sklizeň způsobem popsaným v odstavci Stanovení účinnosti.

Konečná várka vakcíny

Jednotlivé sklizně, které vyhověly výše předepsaným zkouškám, se spojí a znovu čeří. Provede se stanovení bílkovinného dusíku. Může se přidat vhodný stabilizátor a spojené sklizně se vhodně zředí.

Pouze taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě šarže.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu (2. 6.1), na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Obsah bílkovinného dusíku.. Obsah bílkovinného dusíku před přidáním stabilizátoru je nejvýše 0,25 mg v lidské dávce.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů a lyofilizuje se na obsah vlhkosti, která je prokazatelně vhodná pro stabilitu vakcíny. Potom se obaly uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci a vniknutí vlhkosti.

Pouze šarže, která vyhovuje z hlediska tepelné stability a všem požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení obsahu, se může uvolnit k použití. Pokud byla zkouška na ovalbumin provedena s uspokojivými výsledky v konečné várce vakcíny, může se u šarže vypustit.

Tepelná stabilita. Vzorky šarže lyofilizované vakcíny se inkubují v suchém stavu 14 dní při 37 °C. V inkubované i neinkubované vakcíně se souběžně stanoví koncentrace viru, jak je uvedeno v odstavci Stanovení účinnosti. Rozdíl v koncentraci viru mezi inkubovanou a neinkubovanou vakcínou nepřesáhne 1,0 loglo a koncentrace viru v lidské dávce inkubované vakcíny je nejméně počet jednotek tvořících plaky (PFU), odpovídající 1 x 10³ myších LD50.

Zkouška totožnosti

Když se vakcína rekonstituuje podle návodu a smíchá se specifickými protilátkami proti viru žluté zimnice, dojde k signifikantnímu snížení její schopnosti infikovat vnímavé buněčné kultury.

Zkoušky na čistotu

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Ovalbumin. Nejvýše 5 µg ovalbuminu v lidské dávce; stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 5 m.j. bakteriálního endotoxinu v lidské dávce.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení účinnosti

Infekční virus se titruje v buněčných kulturách. K validaci každého stanovení se použije vhodný virový referenční přípravek.

Koncentrace viru je nejméně ekvivalent v PFU 1 x 103 myších LD50 v lidské dávce. Vztah mezi myší LD50 a PFU si stanoví každá laboratoř a schválí jej oprávněná autorita.

Ke stanovení myší LD50 se může použít dále uvedená metoda nebo jiný vhodný postup.

Navržená metoda ke stanovení myší LD50.

Myší LD50. Je to statisticky vypočítané množství virové suspenze, u něhož se očekává vyvolání fatální specifické encefalitidy u 50 % myší vysoce vnímavého kmene, 4 až 6 týdnů stary'ch, po intracerebrální inokulaci.

Připraví se vhodné sériové ředění rekonstituované vakcíny v rozpouštědle pro virus žluté zimnice, jako je např. roztok bovinního albuminu R (7,5 g/l) v tlumivém roztoku fosforečnanovém s chloridem sodným o pH 7,4 nebo jiné rozpouštědlo, které prokazatelně odpovídá udržením infekčnosti viru.

Myším vysoce vnímavého kmene, 4 až 6 týdnů stary'm, se intracerebrálně vstříkne při anestezii 0,03 ml ředění vakcíny. Pro každé ředění se použije skupina o nejméně šesti myších; série ředění se zvolí tak, aby zasahovala od 0 % do 100 % myší mortality. Myši se naočkují ihned po přípravě ředění a pozorují se 21 dní. Všechny úhyny se zaznamenávají. Do výpočtu se zahrnují jenom přežívající myši a úhyny způsobené typickou infekcí žlutou zimnicí. Myši paralyzované dvacátý první den pozorování se počítají jako přežívající.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum. V označení na obalu se uvede:

• kmen viru použitý v přípravku,
• že je vakcína připravena z kuřecích embryí, 
• minimální koncentrace viru,
• varování před stykem s dezinfekčními prostředky,
• doba, do které se má vakcína po rekonstituci použít.